结肠癌根治术后患者胸腺肽静滴辅助FOLFOX4方案化疗前后外周血单个核细胞中Treg比例表达观察

杨飖，宋纯，杜涛，韩俊毅

(同济大学附属东方医院，上海 200123)

结直肠癌是消化道最为常见的恶性肿瘤之一。在我国，结直肠癌占恶性肿瘤病死率的第3～4位[1]。目前结直肠癌主要治疗方法为手术加放化疗，其中FOLFOX4方案化疗在中晚期结直肠癌的综合治疗中有不可替代的作用。增强化疗药物的疗效，对于改善结直肠癌患者的预后具有重要的意义。肿瘤免疫治疗对于改善肠癌患者的预后有着显著的临床疗效，是近来研究热点。其中，调节性T细胞(Treg)发挥了重要作用，通过改变体内Treg的表达量，有可能改善肠癌患者的预后。胸腺肽作为一种免疫增强剂被广泛应用于临床治疗，能非特异性刺激T淋巴细胞的增殖分化和成熟，调节T淋巴细胞亚群比例，增强机体的免疫功能，在肿瘤治疗过程中起着重要辅助作用[2-4]。本研究观察了胸腺肽静脉滴注辅助FOLFOX4方案化疗对结肠癌根治术后患者外周血单个核细胞中Treg比例的影响，从而了解胸腺肽静脉滴注辅助FOLFOX4方案化疗对结肠癌根治术后患者免疫功能的影响及对肿瘤免疫的作用。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2013年6月～2014年6月同济大学附属东方医院接受结肠癌根治术(D3根治术)治疗并经病理确诊的结直肠癌患者55例，手术均顺利完成，无吻合口漏、出血、肠梗阻等并发症发生。患者术后TNM病理分期证实Ⅱ、Ⅲ期结直肠癌患者(Ⅱ期结直肠癌患者含高危因素，包括组织学分化差、T4分期、血管淋巴管浸润、肠梗阻或穿孔、肿瘤太近切缘、送检淋巴结小于12枚)，术前未接受放化疗及免疫治疗，未使用类固醇和免疫抑制剂。患者治疗前均签署知情同意书，治疗方案报伦理委员会审批。55例患者中，男26例，女29例；年龄32～86岁；结肠癌24例，直肠癌31例；根据结直肠癌TNM分期，Ⅱ期25例，Ⅲ期30例；根据组织学分级，高分化3例，中分化39例，低分化13例；根据组织学类型，管状腺癌38例，乳头状腺癌13例，黏液腺癌4例；根据肿瘤大体类型，隆起型6例，溃疡型9例，溃疡浸润型40例；病程3～18个月，平均6.5个月。将观察对象随机分为T-FOLFOX4组(28例)、FOLFOX4组(27例)。

1.2 胸腺肽静滴辅助FOLFOX4方案化疗方法 所有入组对象在术后2周内接受FOLFOX4方案化疗。FOLFOX4方案：奥沙利铂(注射用奥沙利铂50 mg/瓶，江苏恒瑞医药股份有限公司)85 mg/m2静脉滴注2 h，第1天；亚叶酸钙(50 mg/支，山西普德药业有限公司)200 mg/m2静滴2 h，第1、2天；氟尿嘧啶(浙江海正药业股份有限公司)400 mg/m2静注第1、2天；氟尿嘧啶1 200 mg/m2化疗持续泵入46～48 h，每2周为1个周期，共12个周期。T-FOLFOX4组在化疗基础上加用胸腺肽(湖南五洲通药业有限责任公司)200 mg静脉滴注，第1～5天。

1.3 外周血单个核细胞中Treg比例测算 术后化疗前、术后6个月(术后化疗12个周期)、术后12个月(化疗结束6个月)清晨空腹抽取两组静脉血2 mL，EDTA抗凝。吸管加入等体积2 mL的生理盐水，使血液等倍稀释。管中充分混匀。另取试管，加入2 mL淋巴细胞分离液(上海生工公司)，离心管倾斜，用一次性滴管将上述稀释血4 mL在距分离液界面上1 cm处沿管壁缓慢加至分离液上面，稀释血与分离液之比为2∶1。20 ℃恒温1 500 r/min离心20 min。离心后，取出离心管，吸取中层单个核细胞，置入另一离心管中。加入生理盐水吹打均匀后20 ℃恒温1 800 r/min离心10 min，以去除残余的分离液和杂质细胞。再次生理盐水洗涤细胞2次，吹打均匀，配平后每次1 500 r/min离心5 min后重悬，计数并调整细胞密度。在每个流式上样管中加入经上述离心分离所得两组结直肠癌患者单个核细胞悬液，每管细胞数约为1×106个，洗涤2遍。分别加入CD4、CD25单抗(美国BD公司)，混匀后4 ℃避光孵育30 min, 1 000 r/min离心5 min，弃上清，加入1 mL破膜剂，4 ℃避光孵育12 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清。实验组加入稀释好的荧光标记Foxp3抗体2.5 μL，阴性对照加入IgG对照抗体，4 ℃避光孵育30 min，洗涤，离心，加入500 μL PBS混匀，上机检测。

1.4 外周血单个核细胞中Treg标志物Foxp3、CD127 mRNA检测 采用real-time PCR。TRIzol法分别从两组离心分离所得单个核细胞中提取总RNA，逆转录获取cDNA后进行PCR扩增。Foxp3引物：上游5′-CATGCGACCCCCTTTCACCTAC-3′，下游5′-TCTCCACCCGCACAAAGCACTT-3′。CD127引物：上游5′-AAAGGATGAAAACAAATGGACGC-3′，下游5′-ATGCTGATGGTTAGTAAGATAGGAT-3′。内参基因GAPDH引物：上游5′-TTGGCATCGTTGAGGGTCT-3′，下游5′-CAGTGGGAACACGGAAAGC-3′。反应体系20 μL,反应条件：95 ℃变性10 s，61 ℃ 10 s，72 ℃延伸45 s，共40个循环。每个测量组取3个复孔。采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

2 结果

入组55例对象随访12个月，其中49例患者疗效可评价。FOLFOX4组1例患者失访，T-FOLFOX4组2例及FOLFOX4组3例因出现奥沙利铂神经毒性反应及骨髓抑制等化疗毒副作用而退出研究。

2.1 两组外周血单个核细胞中Treg比例比较 见表1。

表1 两组外周血单个核细胞中Treg比例比较

注：与FOLFOX4组比较，*P<0.05，**P<0.01。

2.2 两组外周血单个核细胞中Treg标志物Foxp3、CD127 mRNA表达比较 见表2。

表2 两组外周血单个核细胞中Treg标志物Foxp3、

注：与FOLFOX4组比较，*P<0.05，**P<0.01。

3 讨论

结直肠癌是发达国家和地区导致人死亡的主要疾病之一，但目前治疗效果尚不满意，根治术后5年总体生存率为50%左右。化疗在结直肠癌的综合治疗中起重要作用，尤其是中晚期肠癌患者。然而化疗的临床有效率有限，如何进一步提高化疗药物的疗效有着重要的临床意义。近来研究[5,6]表明，CD4+CD25+Treg能影响机体抗肿瘤免疫功能，与自身免疫耐受和肿瘤免疫密切相关。Treg可以通过分泌TGF-β和IL-10介导细胞免疫抑制，能破坏细胞代谢、溶解细胞，并能影响肿瘤微环境[6,7]。化疗药物的非选择性杀伤作用对于增殖活跃的Treg细胞也有杀伤作用，使化疗后Treg细胞进一步降低，从而也减少了它对肿瘤免疫的抑制。研究[8]发现，肿瘤患者外周血中Treg细胞比例升高，与患者的预后呈负相关。因此，如何调节CD4+CD25+Treg细胞数量已成为抗肿瘤免疫治疗的焦点。

胸腺肽已经广泛应用于肺癌、乳腺癌、恶性黑色素瘤及肾癌等恶性肿瘤的治疗中，国内亦有应用于结直肠癌的研究[9～11]。基础研究表明，胸腺肽可促进T淋巴细胞的成熟，增加抗原或丝裂原激活后T细胞分泌的干扰素α、干扰素γ以及IL-2、IL-3等淋巴因子水平，同时增加T细胞表面淋巴因子受体水平，还可通过对CD4+T细胞的激活，增强异体和自体的人类混合淋巴细胞反应，从而增强机体的免疫功能，同时可调节胸腺细胞及B淋巴细胞的分化及成熟及产生多种生物因子[12]。本研究结果显示，在术后6个月、术后12个月T-FOLFOX4组患者外周血单个核细胞中CD4+CD25+Treg比例较FOLFOX4组显著下降，表明胸腺肽静脉滴注辅助FOLFOX4方案化疗能显著下调结肠癌根治术后患者外周血单个核细胞中Treg比例，从而可能进一步抑制肿瘤免疫。叉头样转录因子家族成员Foxp3是CD4+CD25+Treg细胞比较特异的形态和功能性指标，被认为是其最敏感的标志物[13,14]。多数CD4+CD25+Treg细胞低表达CD127分子，并且CD127与Foxp3表达负相关[15]。因此，为进一步研究胸腺肽辅助FOLFOX4对CD4+CD25+Treg的影响，我们检测外周血单个核细胞中CD4+CD25+Treg的标志物Foxp3 mRNA和CD127 mRNA的变化。本研究结果发现，在术后6个月、术后12个月T-FOLFOX4组患者外周血单个核细胞中Foxp3、CD127 mRNA较FOLFOX4组表达降低。

综上所述，胸腺肽静脉滴注辅助FOLFOX4方案化疗能够明显降低结直肠癌根治术后患者外周血单个核细胞中Treg的比例，从而使得化疗后机体的细胞免疫功能得到很大的改善，以增强机体免疫监视功能，可为抗肿瘤免疫提供一种新的治疗途径，但胸腺肽介导的抗肿瘤免疫作用的确切机制还有待于深入研究。