非肝炎病毒相关性肝细胞癌组织中鸟苷酸交换因子ECT2的表达变化及其意义

夏念信，赵文超，马鹏飞，王敬晗，祝建勇，邱宝安

(海军总医院，北京 100438)

肝细胞癌(以下简称肝癌)是最常见的肝脏原发性恶性肿瘤，为世界范围内肿瘤所致男性第二位、女性第六位的死亡原因[1]。由于肝癌起病隐匿，大多数患者在确诊时已失去手术机会[2]。由于肝癌血管侵犯、远处转移、肝内播散的生物学特点，导致其手术效果差，术后复发概率高。因此多学科综合治疗(MDT)策略逐步得到重视。其中靶向药物的筛查和选择逐步成为肝癌治疗的重要一环。上皮细胞转化序列癌基因(ECT2癌基因)，其编码蛋白为鸟苷酸交换因子ECT2。既往的研究表明，ECT2能够作用于RhoA GTP酶家族成员，通过催化鸟苷酸交换，起到调节细胞分裂的作用[3]。ECT2在多种肿瘤组织中高表达，其产物能够调控细胞增生与凋亡[4,5]。已有研究表明，ECT2在肝癌术后早期复发病灶样本中表达水平增加，并与预后相关[6]。但肝癌的致病因素较多，乙肝及丙肝病毒感染所致的慢性肝炎是肝癌发生及早期复发的重要因素。但非病毒相关性危险因子，如乙醇摄入等也发挥了重要作用，且与肝炎病毒相关性是否具备相同的致癌机理尚不明确。本研究观察了非肝炎病毒相关性肝癌组织中ECT2的表达变化，并探讨其与肝癌患者临床病理特征的关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源及处理 收集2004年1月～2010年1月海军总医院肝胆外科的78例非肝炎病毒相关性肝癌手术切除标本，同时每例患者另取距癌组织2～5 cm处的癌旁组织标本作为对照。78例非肝炎病毒相关性肝癌患者中男56例、女22例，年龄24～69岁、中位年龄54岁，术后病理诊断均为肝癌，以上患者均未行术前新辅助化疗或靶向药物治疗。患者随访60个月，中位生存时间43个月。将所有标本分两部分，其中一部分用4%甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片机切成4 μm厚的连续石蜡切片备用；另一部分液氮速冻后-80 ℃冰箱保存。

1.2 肝癌及其癌旁组织ECT2蛋白检测 采用免疫组织化学染色法。常规固定，石蜡包埋，脱蜡、水化后采用三步免疫组化染色法(SP法，试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司)检测ECT2蛋白的表达。具体操作步骤如下：柠檬酸盐缓冲液抗原修复，3% H2O2室温孵育，磷酸盐缓冲液冲洗，滴加1∶50稀释的ECT2兔抗人多克隆抗体(Ahmar公司)，4 ℃冰箱孵育过夜，DAB(试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司)显色，苏木素对比染色，逐级脱水、透明、封片，于显微镜下观察、摄片并分析。以磷酸盐缓冲液替代一抗作为阴性对照。结果判定：免疫组化染色阳性标本的细胞质或细胞膜应呈清晰黄褐色颗粒为阳性表达，高倍镜(×400)下随机观察5个视野，根据阳性细胞百分率和染色强度进行半定量分析。染色强度：无染色计0分，轻度染色计1分，中度染色计2分，强染色计3分；阳性细胞数<10%计0分,10%～25%计1分,>25%～50%计2分，>50%计3分。将两项指标评分相乘，0～1为阴性，≥2为阳性。由两位病理科医师双盲法计数，差异超过10%需重新计数。

1.3 肝癌及其癌旁组织ECT2 mRNA检测 采用RT-PCR技术。按照说明书利用TRIzol试剂(美国Invitrogen公司)提取肝癌组织及癌旁组织的总RNA，紫外分光光度计测其浓度，而后按照逆转录说明书进行逆转录，取得cDNA。内参及ECT2引物由Invitrogen公司合成。ECT2引物序列上游：5′-ATTTTATCCACTAGCAAATCTTGATTTAGT-3′；下游：5′-ACAAATCATGGCTGAAAATAGTGTATTAAC-3′，扩增产物为254 bp。GAPDH引物序列上游：5′-GGGTGTGAACCATGAGAAGTATO-3′；下游:5′-GATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′，扩增产物为268 bp。PCR反应体系共25 μL:2×Taq PCR Master Mix(北京天根生化科技有限公司)12.5 μL，上下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，模板cDNA 1 μL，无核酶水9.5 μL;反应条件94 ℃预变性3 min，然后进行30个循环扩增(94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，72 ℃延伸反应5 min)。2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下观察结果。采用2-ΔΔCt法计算目的基因相对表达量。

2 结果

2.1 非肝炎病毒相关性肝癌及其癌旁组织ECT2蛋白及其mRNA表达比较 非肝炎病毒相关性肝癌及其癌旁组织ECT2蛋白表达阳性率分别为71.8%(56/78)、38.5%(30/78)，ECT2 mRNA相对表达量分别为0.53±0.05、0.38±0.09，两者比较P均<0.05。

2.2 ECT2蛋白表达与非肝炎病毒相关性肝癌临床病理特征的关系 ECT2蛋白表达阳性、阴性患者年龄分别为(49.00±5.65)、(53.00±4.32)岁，两者比较P>0.05。ECT2蛋白表达与非肝炎病毒相关性肝癌其他临床病理特征的关系见表1。

3 讨论

肝癌一直是治疗的难题，外科切除仍然是最有效的手段。然而，由于肝癌起病较隐匿，大多数患者确诊时已无法手术切除；另外，即便是接受了根治性手术，术后肿瘤的复发和转移仍然是影响手术效果的首要原因。

表1 ECT2蛋白表达与非肝炎病毒相关性肝癌

基于上述现状，MDT逐步成为肿瘤治疗的基本理念。在此背景下，寻找肝癌发生发展过程中的基因变化，作为药物治疗的靶点，有着重要的临床意义。ECT2基因定位于人染色体3q26.31，具有高度的进化保守性，由883个氨基酸编码构成的蛋白质，相对分子质量约为104 000[7]。研究发现，其在多种肿瘤细胞中高表达，因此也被视为癌基因[8]。ECT2通过作用于Rho GTP酶家族成员，催化鸟苷酸交换，从而起到调节细胞分裂的作用[9]；同时，由于Rho GTP酶家族成员对细胞的骨架重构及黏附性调节方面亦发挥重要作用，因此ECT2还与肿瘤的侵袭性显著相关[10]。有研究发现，在卵巢癌及肺癌细胞中ECT2可以激活Rac1基因，辅助Rac1在细胞核中募集，促使细胞癌变及增殖。敲除ECT2基因则会抑制肺腺癌细胞的增生及侵袭性[11,12]。结合患者的临床病理数据，ECT2高表达与肺鳞癌患者的总生存时间及无瘤生存时间均显著相关[11]。在非小细胞性肺癌中也有发现类似的结果[13]。同时，ECT2也作为各种肿瘤调节因子的作用靶位发挥作用。在非小细胞肺癌及乳腺癌细胞系上发现野生型p53基因可以通过作用于蛋白甲基转移酶抑制ECT2的表达。而泛素连接酶之一E6AP，也是通过ECT2依赖的机制，发挥调节肿瘤转移的作用[14]。基于上述一系列发现，ECT2已作为肿瘤细胞转化、播散过程中的重要参与者，有着重要的应用前景。

目前，针对ECT2在肝癌发生、发展领域的研究较少。一项来自新加坡国立癌症中心的研究发现，ECT2在肝癌组织中表达显著升高，并且与肿瘤早期复发显著相关。进一步的机制研究提示，ECT2在细胞增殖、癌基因转化、肿瘤发生发展及转移过程中均发挥了重要角色，ETC2/Rho/ERK信号通路部分介导了ECT2的功能[6]。但在该研究中，并未根据病因将肝癌分别进行研究。大量研究证实，肝癌的发生与肝炎病毒感染所致慢性肝病显著相关。然而，非肝炎病毒相关性肝癌亦占据一定比例。两者在发生、发展过程中是否具备相同的机制仍无定论。既往大多数肝癌的研究并未根据肝癌的成因进行分类，大多数纳入标本均为肝炎病毒相关性肝癌，缺乏对非肝炎病毒相关性肝癌相关机制的探索。基于此，本研究在前述研究的基础上，分析了ECT2在非肝炎病毒相关性肝癌组织中的表达并初步分析其临床意义。本研究结果发现，非肝炎病毒相关性肝癌组织ECT2蛋白及mRNA表达高于癌旁组织。上述结果均提示，在非肝炎病毒相关性肝癌组织中，ECT2也呈现高表达状态。表明，在这类肝癌的发生发展过程中，ECT2基因及其表达产物参与其中并发挥了重要作用。目前的研究表明，肿瘤的生物学特点，包括分化程度、侵袭性、血管生成、免疫原性等，是肿瘤复发、转移的基础。基于上述共识，我们选择性收集了目前公认的与肿瘤生物学特征直接相关的指标，并评价其与ECT2表达的关系。结果提示肝癌患者低肿瘤分化者、肿瘤直径≥5 cm者、甲胎蛋白水平≥100 ng/mL者、有微血管癌栓者均较中高肿瘤分化者、肿瘤直径<5 cm者、甲胎蛋白水平<100 ng/mL者、无微血管癌栓者ECT2蛋白表达阳性例数多。大量研究表明，甲胎蛋白水平与原发性肝癌的分化程度及预后显著相关[12]，甲胎蛋白水平越高，预示着肿瘤分化程度低，无论是手术还是移植后复发转移概率显著增加。经过门静脉系统肝内转移是肝癌的主要转移途径，因此术后病理切片提示微血管癌栓的出现被认为是术后复发的主要危险因素之一[15]。同时微血管癌栓的发生也反映了肿瘤细胞黏附性的改变。本研究结果与既往ECT2调节细胞的骨架重构及黏附性的研究发现一致。通过与上述临床病理特征的比较，表明ECT2的表达与非肝炎病毒相关性肝癌的生物学特征显著相关，直接参与了肿瘤的转移和复发，有着重要的临床意义。

综上可见，非肝炎病毒相关性肝癌组织中ECT2表达高，ECT2蛋白表达可能与肝癌的复发、转移有关。表明通过抑制ECT2表达，有可能降低肿瘤的发生，这为原发性肝癌患者及其他肿瘤患者的预后判断及靶向治疗靶点的选择提供重要的实验基础及理论基础，为以后的研究提供重要线索。