淋巴瘤组织中survivin、Cyclin D1蛋白的表达观察

王黎，武伦，魏广民

(1湖北医药学院附属人民医院，湖北十堰442000；2湖北医药学院附属东风医院)

淋巴瘤是指来源于淋巴细胞及其前体细胞的恶性肿瘤，在我国占所有恶性肿瘤的3%～4%，且近年来其发病率呈较为明显的上升趋势[1]。淋巴瘤种类繁多，非霍奇金淋巴瘤(NHL)与霍奇金淋巴瘤(HL)在病理形态、免疫表型、临床特征、治疗方法和预后等方面都有很大差别[1]。按目前经典的治疗方案进行治疗，淋巴瘤患者仅有约40%可以得到长期缓解，而绝大多数患者的治疗效果欠佳，因此，有必要更为深入地研究淋巴瘤的发病机制[2]。正常细胞通过信号转导精密地调控着细胞分裂及增殖，当细胞内促进细胞生长和拮抗细胞生长的信号转导出现失衡，将导致细胞增殖失控，细胞有恶性转化可能。有研究发现淋巴瘤细胞有特异性的生存素(survivin)、细胞周期蛋白(Cyclin)D1的表达，而两者与细胞周期的调控有着十分重要的关联。survivin蛋白是凋亡抑制蛋白家族中最小的分子，被认为是最强大的凋亡抑制因子[3，4]，除了胚胎组织中有表达，在正常人组织中不表达，但其在许多肿瘤中异常高表达，且与肿瘤的发生、发展和预后密切相关[5]。survivin蛋白在各种恶性肿瘤(如胃癌、卵巢癌、肺癌和淋巴瘤)中都不同程度的高表达，是肿瘤预后不良的重要指标[6]。Cyclin D1是极为重要的细胞周期调节因子，与肿瘤细胞异常增殖有着十分密切的关系[7]。2015年3月～2017年3月，我们采用MaxvisionTM/HRP免疫组织化学染色法对61例淋巴瘤患者的病变淋巴瘤组织和28例淋巴结反应性增生患者的病变淋巴结组织中的survivin蛋白、Cyclin D1蛋白进行了检测，观察其表达变化。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 经病理学检查证实的淋巴瘤患者61例，男42例，女19例；年龄11～86岁；病理组织分型为NHL 52例、HL 9例；Ann Arbor临床分期为Ⅰ期22例、Ⅱ期12例、Ⅲ期17例、Ⅳ期10例；参照1993年“国际淋巴瘤预后指标”进行恶性程度分级，分为低度恶性淋巴瘤(Ⅰ期、Ⅱ期)34例、高度恶性淋巴瘤(Ⅲ期、Ⅳ期)27例；61例淋巴瘤患者均留取病变淋巴瘤组织。以28例淋巴结反应性增生患者的病变淋巴结组织作对照。

1.2 试剂 survivin抗体(产品编号RAB-0536)、Cyclin D1抗体(产品编号RMA-0541)、快捷免疫组织化学MaxvisionTM/HRP检测试剂盒(产品编号Kit-5030)、DAB染色试剂盒(产品编号Kit-0016)均购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.3 survivin蛋白、Cyclin D1蛋白的检测方法 采用MaxvisionTM/HRP免疫组织化学染色法。以PBS代替一抗作为阴性对照，用已知阳性切片作阳性对照。实验方法、具体操作步骤、判定方法及标准同文献[8]。survivin蛋白主要定位在细胞质内，呈淡黄、棕黄或棕褐色颗粒(阳性)，细胞质不着色或着色浅且不特异者为阴性。Cyclin D1蛋白主要定位在细胞核，呈淡黄、棕黄或棕褐色颗粒(阳性)，细胞核不着色或着色浅且不特异者为阴性。以阳性细胞<25%为低表达、≥25%为高表达。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。计数资料比较用χ2检验、Fisher精确概率法，等级相关资料分析用非参数Spearman检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 淋巴瘤患者的病变淋巴瘤组织、淋巴结反应性增生患者的病变淋巴结组织中survivin蛋白与Cyclin D1蛋白的定位及表达比较 淋巴结反应性增生患者的病变淋巴结组织中survivin蛋白染色细胞较少，淋巴瘤患者的病变淋巴瘤组织中survivin蛋白染色细胞呈弥漫性或灶性分布。61例淋巴瘤患者的病变淋巴瘤组织survivin蛋白阳性表达率为57.38%(35/61)、28例淋巴结反应性增生患者的病变淋巴瘤组织阳性表达率为21.43%(6/28)，两者相比，χ2=9.982，P<0.01。

淋巴结反应性增生患者的病变淋巴结组织中Cyclin D1蛋白染色细胞较少，淋巴瘤患者的病变淋巴结组织中Cyclin D1蛋白染色细胞多且主要位于细胞核内。61例淋巴瘤患者的病变淋巴结组织Cyclin D1蛋白阳性表达率为39.34% (24/61)、28例淋巴结反应性增生患者的病变淋巴结组织阳性表达率为0 (0/28)，两者相比，χ2=13.152，P<0.01。

2.2 淋巴瘤组织中survivin蛋白、Cyclin D1蛋白表达与淋巴瘤患者临床病理参数的关系 survivin蛋白的阳性表达与淋巴瘤患者年龄、性别、HL/NHL、免疫表型、B组症状及结外累计部位数无明显相关性(P均>0.05)，而与血清乳酸脱氢酶(LDH)水平升高、临床分期高及恶性程度高有明显相关性(P均<0.05)。Cyclin D1蛋白的阳性表达与患者性别、年龄、结外累计部位数、血清LDH水平升高、HL/NHL及免疫表型无明显相关性(P均>0.05)，与B组症状、临床分期高及恶性程度高有明显相关性(P均<0.05)。结果详见表1。

表1 淋巴瘤组织中survivin蛋白、Cyclin D1蛋白表达与淋巴瘤患者临床病理参数的关系(例)

2.3 淋巴瘤组织中survivin蛋白与Cyclin D1蛋白表达的相关性 在61例淋巴瘤患者中，其淋巴瘤组织中survivin蛋白与Cyclin D1蛋白均呈阳性表达18例，survivin阳性表达而Cyclin D1阴性表达17例，survivin阴性表达而Cyclin D1阳性表达6例，survivin蛋白与Cyclin D1蛋白均呈阴性表达20例，survivin、Cyclin D1蛋白表达呈正相关(r=0.287，P<0.05)

3讨论

survivin是从人类基因组中筛选出的一个基因[1]。survivin作为凋亡抑制家族的重要成员之一，主要通过拮抗肿瘤细胞的凋亡、增强肿瘤细胞的恶性生物学行为而促进肿瘤的发生、发展[9]。本研究结果显示，28例淋巴结反应性增生患者的病变淋巴结组织中survivin蛋白阳性表达率为21.43%，61例淋巴瘤患者的病变淋巴结组织中survivin蛋白阳性表达率为57.38%，淋巴瘤组织中survivin蛋白阳性细胞呈弥漫性或灶性分布，与文献[10]报道相符。survivin蛋白可促进淋巴瘤细胞逃避生长监视，提高细胞存活能力，有助于促进淋巴瘤的发生、发展。本研究结果显示，survivin蛋白的高表达与淋巴瘤患者的性别、年龄、HL/NHL、免疫表型、B组症状及结外累计部位数多无明显相关性，而与血清LDH水平高、临床分期高及恶性程度有明显相关性，与文献[11]报道一致。有研究[9]表明，survivin基因在大多数常见恶性肿瘤组织中过表达，如肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、结直肠癌、胰腺癌及前列腺癌，并与其相应的组织学分级、临床分期有着十分紧密的关联。有研究[1]报道，利用RNA干扰技术抑制survivin基因的表达，可诱导人HL-60白血病细胞凋亡。结合本研究，我们推测在survivin或许也可作为淋巴瘤基因治疗的新靶点。

Cyclin D1蛋白是一个细胞周期相关核蛋白，主要参与促进细胞周期的G1期进入S期[12]。G1/S期是细胞周期的关键调控阀门，而Cyclin D1蛋白是调控该阀门的一个重要因素。Cyclin D1在促进细胞增殖中起着十分重要的作用[13]。细胞周期蛋白依赖性激酶与Cyclin D1蛋白结合，共同调节细胞周期。往往在细胞周期的G1期仅合成少量的Cyclin D1蛋白[14]。然而在部分肿瘤细胞中，由于丧失对部分基因的控制，导致Cyclin D1蛋白过度表达。Cyclin D1蛋白大量表达可缩短G1期，加快G1期进入S期，促进了细胞周期的进程[8]。Cyclin D1基因过度表达，细胞增殖速度增强，可能为细胞恶性转化创造了契机[15]。因此，在细胞增殖和分化中，Cyclin D1基因起着十分重要的调控作用。本研究结果显示，28例淋巴结反应性增生患者的病变淋巴结组织中Cyclin D1蛋白染色细胞较少，阳性表达率为0，而在61例淋巴瘤患者的病变淋巴结组织中Cyclin D1蛋白阳性表达率为39.34%，与文献[16]报道相符，提示Cyclin D1蛋白高表达可能是淋巴瘤发生、发展过程中十分重要的生物学标志。Cyclin D1蛋白的过度表达与患者性别、年龄、结外累计部位数、LDH增高、HL/NHL及免疫表型无明显相关性，与B组症状、临床分期高及恶性程度有明显相关性，进一步提示Cyclin D1蛋白高表达可能是淋巴瘤发生、发展的重要生物学标志。Cyclin D1蛋白异常表达与肿瘤的关系十分密切，其在消化系统、生殖系统等多种恶性肿瘤中亦呈过度表达[14]。在目前对淋巴瘤诊断较难的情况下，检测Cyclin D1对淋巴瘤的诊断和恶性程度判断有重要参考价值。

细胞周期是指细胞从一次分裂结束开始到下一次分裂完毕所经过的整个过程，分为间期与分裂期(M期)两个阶段。间期又分为三期，即DNA合成前期(G1期)、DNA合成期(S期)与DNA合成后期(G2期)。Cyclin D1是细胞周期中G1/S期的关键性限制点，survivin是细胞周期中G2/M期的关键性限制点[8]。细胞周期的正常运行过程中，survivin、Cyclin D1基因对其进行严密的调控。本研究结果显示，淋巴瘤患者的淋巴瘤组织中，survivin蛋白与Cyclin D1蛋白的表达呈正相关关系。推测两者可能在淋巴瘤发生发展过程中发挥协同作用。

综上所述，survivin蛋白与Cyclin D1蛋白在淋巴瘤组织中均呈高表达，两者有可能成为淋巴瘤诊断的标志物，并可协助判断淋巴瘤的恶性程度，二者在淋巴瘤的发生、发展过程中可能发挥协同作用。