支气管哮喘急性发作期患儿外周血去整合素金属蛋白酶8、干扰素调控因子1水平观察

李文开，钟礼立，李云，黄寒，梁沫，易红玲

(湖南省人民医院/湖南师范大学附属第一医院，长沙410005)

支气管哮喘是以气道慢性炎症为主要特征的呼吸系统疾病，由多种细胞如中性粒细胞、T淋巴细胞、肥大细胞等炎症细胞及其合成和分泌的炎症细胞因子相互作用所致，好发于儿童[1]。流行病学调查[2]显示，儿童支气管哮喘发病率为2%～7%。儿童支气管哮喘急性发作可导致支气管炎性细胞浸润、黏膜充血、分泌物增多等，阻塞患儿气道，使呼吸阻力增加以及支气管痉挛，加重患儿喘憋性呼吸困难及缺氧状态[3]。早期诊断支气管哮喘并及时评估病情严重程度，对制定针对性治疗方案、改善患儿预后有重要意义。有研究[4]认为，炎症反应、免疫功能异常等与支气管哮喘发病密切相关。去整合素金属蛋白酶(disintegrins metalloproteinase，ADAM)8属于解聚素和金属蛋白酶家族成员，ADAM8与气道炎症反应密切相关[5]。干扰素调控因子(interferon regulatory factor，IRF)1是核转录因子，主要介导了细胞免疫过程[6]。关于ADAM8、IRF1在小儿支气管哮喘发病过程中的作用，目前相关研究相对较少。本研究观察了支气管哮喘急性发作期患儿外周血ADAM8、IRF1水平变化。现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2016年6月～2018年3月湖南省人民医院收治的支气管哮喘急性发作期患儿91例(急性发作组)。纳入标准：满足2016年中华医学会儿科学分会呼吸学组修订的儿童支气管哮喘诊断与防治指南[7]中的第1～4条，或者满足第4、5条。排除标准：①心脏功能不全者；②肝、肾功能障碍者；③纳入研究前的1个月内接受过糖皮质激素或者免疫抑制剂治疗者；④有药物治过敏史者；⑤恶性肿瘤患者。按照“全球哮喘防治倡议”[8]标准将急性发作组患儿分为轻度组27例(男15例、女12例，年龄3～14岁)、中度组35例(男21例、女14例，年龄4～13岁)、重度组29例(男17例、女12例，年龄3～13岁)。同期随机选取60例支气管哮喘缓解期患儿为缓解组(男34例、女26例，年龄4～14岁)，60例健康体检儿童为对照组(男38例、女22例，年龄3～14岁)。各组性别、年龄有可比性(P均>0.05)。本研究获医院伦理委员会批准，研究对象及家属知情同意。

1.2 外周血ADAM8、IRF1 mRNA检测 采用荧光定量PCR法。收集研究对象清晨空腹肘静脉血4 mL于EDTA抗凝管中，根据Ficoll-hypaque密度梯度离心法将外周血中单个核细胞分离，置于TRIzol(瑞士Roche公司提供)中，-80 ℃保存备检。用TRIzol提取外周血单个核细胞中的总RNA，利用反转录试剂盒逆转录合成cDNA。ADAM8上游引物序列为5′-GGGAGAAACAACGAAGTTG-3′，下游引物序列为5′-GGTGTGATCAAGCACAGAT-3′，长度为256 bp；IRF1上游引物序列为5′-GCGGCACCTGGCGCACGGCT-5′，下游引物序列为5′-GGTGGAAGCACCAAGAC-3′，长度为128 bp；内参照β-actin上游引物序列为5′-GTGACGTGGACAATCCGCAAG-3′，下游的引物序列为5′-GGAAGGTGGACAACGGACGC-3′，长度为25 bp。采用荧光定量PCR法检测ADAM8、IRF1 mRNA。扩增反应条件：95 ℃、2 min，95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，72 ℃持续20 s，共计40个循环，每个样品重复上述操作3次。ADAM8 mRNA及IRF1 mRNA表达水平采用2-ΔΔCt表示。

1.3 ADAM8、IRF1蛋白检测 采用BCA试剂盒测定外周血单个核细胞中总蛋白，Western blotting法检测ADAM8、IRF1蛋白，严格按照试剂盒说明进行相关操作。

1.4 肺功能测定 采用耶格肺功能检测仪检测各组患儿肺功能指标，包括第1秒用力呼气量(forced expiratory volume in one second，FEV1)、用力肺活量(forced vital capacity，FVC)、用力呼气峰流速(peak expiratory flow，PEF)。

2 结果

2.1 各组外周血ADAM8、IRF1 mRNA及蛋白水平比较 急性发作组中的轻度组、中度组、重度组患儿外周血ADAM8、IRF1 mRNA及蛋白水平高于缓解组和对照组，并且轻度组、中度组、重度组患儿外周血ADAM8 mRNA、IRF1 mRNA及蛋白水平逐渐升高，见表1、2。

2.2 各组肺功能指标比较 急性发作组中的轻度组、中度组、重度组患儿FEV1、FVC、FEV1/FVC、PEF低于缓解组和对照组，并且轻度组、中度组、重度组患儿外周血FEV1、FVC、FEV1/FVC、PEF逐渐降低，见表3。

表1 各组外周血ADAM8、IRF1 mRNA表达水平比较

注：与缓解组、对照组相比，*P<0.05；与轻度组相比，△P<0.05 ；与中度组相比，#P<0.05。

表2 各组外周血ADAM8、IRF1蛋白相对表达量比较

注：与缓解组、对照组相比，*P<0.05；与轻度组相比，△P<0.05 ；与中度组相比，#P<0.05。

表3 各组肺功能指标比较

注：与缓解组、对照组相比，*P<0.05；与轻度组相比，△P<0.05 ；与中度组相比，#P<0.05。

2.3 急性发作组患儿外周血ADAM8 mRNA、IFR1 mRNA水平的相关性及其与肺功能指标的相关性 急性发作组患儿外周血ADAM8 mRNA与IFR1 mRNA水平呈正相关(r=0.793，P<0.05)，ADAM8 mRNA水平与FEV1、FVC、FEV1/FVC、PEF呈负相关(r分别为-0.659、-0.702，-0.683、-0.761，P<0.05)，IFR1 mRNA与FEV1、FVC、FEV1/FVC、PEF水平呈负相关(r分别为-0.712、-0.735，-0.728、-0.756，P均<0.05)。

3 讨论

目前，临床主要根据患儿临床表现、肺功能检查等诊断支气管哮喘，但不能全面有效评估病情而为临床用药提供指导。同时，年龄小于6岁的患儿肺功能检查的依从性低，以致结果不稳定，准确性相对较低。寻找简便、高效、重复性好的指标辅助临床诊断支气管哮喘，对指导临床制定针对性治疗方案具有重要意义。

研究[9]表明，气道炎症与支气管哮喘发病密切相关，多种免疫细胞和炎症因子介导了其发生、发展过程。ADAM是主要在免疫细胞如嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞中表达的分泌型糖蛋白，其主要功能是调控炎症细胞迁移以及参与恶性肿瘤的发病过程[10]。ADAM8属于ADAM家族成员，具有824个氨基酸残基膜蛋白，主要表达于细胞的胞质及胞膜中。研究[11]显示ADAM8过度表达参与了肺癌等恶性肿瘤的发生、发展。Knolle等[12]对炎症小鼠模型的研究发现，ADAM8能诱导炎症细胞凋亡，清除肺部炎症细胞，并进一步推断ADAM8具有抗炎作用。Oreo等[13]发现严重哮喘患者痰液中ADAM8表达上调，并且与气道中炎症细胞的聚集密切相关，提示ADAM8可使哮喘患者炎症细胞迁移至气道。IRF是主要在细胞核中表达的转录因子，在干扰素信号通路的作用下调控多种基因的表达，进而参与细胞增殖、分化、细胞免疫等[14]。李茉莉等[15]研究IRF1在大鼠感染呼吸道合胞病毒中的作用，证实了IRF1通过介导大鼠神经源性炎症介质表达而参与气道炎症的发生过程。梁雯慧等[16]发现IRF1表达异常参与调节炎症反应，进而引起哮喘发生。

本研究结果显示，支气管哮喘急性发作期患儿外周血中ADAM8 mRNA和IRF1 mRNA水平高于缓解组和对照组，并且急性发作期患者哮喘病情越严重，ADAM8 mRNA和IRF1 mRNA水平也高。进一步比较ADAM8、IRF1蛋白在各组中的表达水平，也得到相似结果。上述结果说明ADAM8、IRF1高表达可能通过介导气道炎症反应而诱导支气管哮喘的发作，并促进病情的进展。支气管哮喘急性发作期患儿外周血ADAM8 mRNA与IRF1 mRNA水平呈正相关，提示两种标志物通过协同作用引起气道炎症反应，共同介导支气管哮喘的发病进程。

支气管哮喘急性发作对患儿肺功能造成不同程度的损伤，病情越严重则肺功能损伤越严重。本研究发现，支气管哮喘急性发作期患儿肺功能指标FEV1、FVC、FEV1/FVC、PEF低于缓解组和对照组，并且病情越严重的患儿其FEV1、FVC、FEV1/FVC、PEF水平越低，提示上述指标能有效评估支气管哮喘患儿病情严重程度。支气管哮喘急性发作患儿外周血ADAM8 mRNA和IRF1 mRNA水平与其FEV1、FVC、FEV1/FVC、PEF呈不同程度负相关，说明ADAM8、IRF1异常表达水平越高，患儿炎症反应越明显，支气管哮喘病情进展越快，病情越重，肺功能损伤加重，提示外周血ADAM8、IRF1可作为评估支气管哮喘病情严重程度的重要标志物。

综上所述，ADAM8、IRF1异常表达介导了小儿支气管哮喘急性发作的发生、发展过程，并且与肺功能损伤程度有关，可作为临床辅助评估小儿支气管哮喘急性发作严重程度的指标，也可指导临床用药。