乳酸菌作为DNA疫苗载体的研究进展

易德玮，罗 玲，杨坤明，韩奇鹏

（湖南正虹科技发展股份有限公司，湖南 岳阳 414418）

随着对疫苗传递系统的深入研究，科学工作者们期望找到一种能在机体体内较长时间存在、且对机体本身安全又能产生持续免疫力的传递载体，而乳酸菌是一类食品级、非侵袭及非致病性的微生物，是动物胃肠道常在菌群，将其作为载体系统来表达外源蛋白有着不可替代的优点[1-2]。科学工作者们试图利用其定植肠道发挥表达抗原的黏膜免疫效果的特点而应用在疫苗的研发中[3-4]。近年来，乳酸菌质粒载体系统、食品级载体及电穿孔转化技术发展迅速，以乳酸菌作为研制载体疫苗成为可能[5]。本文就乳酸菌作为DNA疫苗载体进行综述。

1 DNA疫苗

DNA疫苗是编码免疫原或与免疫原相关因子的真核表达质粒DNA或RNA，是20世纪90年代初出现的继减毒疫苗、基因工程疫苗后的第三代新型疫苗，具有免疫效果好、容易制备、生产成本低、临床应用方便等优点[6]。DNA疫苗经多种接种途径进入动物体内，被动物宿主细胞摄取后能转录和翻译表达出的抗原蛋白通过刺激机体产生非特异性和特异性两种免疫应答反应，从而起到免疫保护作用。据报道埃博拉病毒、疟疾、艾滋病和肿瘤等DNA疫苗已相继通过美国食品药品监督管理局（FDA）批准进入临床试验[7-8]。

DNA疫苗的优点：比传统疫苗安全、稳定性好、用量少且效果好[6,9]。尽管DNA疫苗与弱毒疫苗免疫原性相当，但是DNA序列编码的仅是单一的一段病毒基因，基本没有毒性逆转的可能，故不存在减毒疫苗毒力回升的致病危险[10]。DNA疫苗生产成本低廉，贮存方便，且适于大批量生产[11]。DNA接种载体（如质粒）的结构简单，提纯质粒DNA的工艺简便，并且DNA分子克隆较容易，故DNA疫苗可根据需要随时进行更新，此外，质粒本身可作为佐剂，故不需额外再加佐剂[12]。相较于原核表达，DNA疫苗可以在递送病毒或寄生虫抗原的过程中，对抗原表位进行翻译后的糖基化加工，这对某些抗原表位的构象非常重要，而原核表达系统中没有糖基化过程，因此更适用于原核病原菌。

DNA疫苗的不足之处：DNA疫苗作为基因调控的方式，附带的外源基因也被导入机体后，该外源基因可能会激活宿主内源性原癌基因或使宿主抑癌基因失活，会使疫苗具有较低的免疫原性，还能引发机体产生抗DNA抗体，目前研究人员们暂时没检测出DNA疫苗相关基因组整合到宿主细胞中[13-14]。

2 乳酸菌表达系统的特点

Pouwels等试验发现，乳酸杆菌表达系统可将外源蛋白表达于菌体细胞内，外源蛋白分泌效率高有利于促进局部或全身黏膜免疫反应，表明乳酸杆菌作为活菌的疫苗抗原载体能够表现出较高的安全性[15]。乳酸菌作为一种原核表达系统，在保证机体安全的前提下，能够发挥持续且高效的免疫力，该菌之所以能作为极具开发前景的理想抗原呈递载体，有以下特点：易培养，且某些菌种自带染色体外因子可构建出新的表达载体系统；遗传操作方法简便、且重复性好、效率高；乳酸菌安全性较高，表达的外源蛋白无需进行纯化，便可直接连同菌体一起服用；具有高度且可调控的启动子系统，能表达毒素基因；能保障基因工程产品的相对安全性，构建出可供直接口服的食品级表达系统，如糖诱导表达系统，乳链球菌素调控表达系统，噬菌体Φ31爆发式诱导的表达系统，pH调控表达系统等；能有效刺激机体产生免疫反应和免疫耐受，且持续时间较长；外源蛋白在细胞内外均可获得良好的表达效果[16-17]。

3 乳酸菌在DNA疫苗中的作用机理

乳酸菌一直被应用于食品发酵和保存中,属于食品级的细菌，其本身可作为DNA疫苗载体，因无侵入能力，故其递送DNA的能力不强，而减毒沙门菌这类弱致病菌由于可侵入到细胞中，因此可以能更好的递送DNA，因此通过模拟病原菌的侵入过程，应用基因克隆、遗传修饰等方法构建侵入型重组乳酸菌，可以使其具有更好的递送能力。根据乳酸菌质粒载体上启动子类型的不同，可将其分为组成型表达载体和诱导型表达载体，乳链菌肽诱导表达载体是目前最具应用前景的乳酸菌诱导型表达载体，已成功地表达了同源或异源的菌体蛋白、酶类、膜蛋白、细菌素及某些抗原类等[18-19]。另外，疫苗载体菌株的不同会影响重组乳酸菌疫苗的免疫效果[20-21]。主要是因为不同乳酸菌在胃肠道存活率、体内定植状况、免疫调节功效及其与GALT的作用方式等方面均存在差异，而乳酸乳球菌作为表达外源蛋白的理想菌株有其独特优势，经实践证明是较安全的，其自身分泌蛋白较少[22]。此外，由于乳酸乳球菌不属于人和动物的共生菌群，基本不在胃肠道内定植，可避免定植而导致的免疫耐受[4,23]。

4 乳酸菌在DNA疫苗中的作用研究进展

乳酸乳球菌可以大量产生并递送抗原及细胞因子，时下已成为口服DNA疫苗的运载工具。为了增加DNA的递送能力，研究人员试图通过改造乳酸菌使其成为具有侵入能力的乳酸菌。金黄色葡萄球菌是一种具有侵入宿主细胞能力的病原菌，经研究表明其细菌表面表达的纤连蛋白结合蛋白A（Fn⁃BPA）对其侵入能力起着绝对重要的作用[24]。由此可知在乳酸乳球菌中表达外源FnBPA后会使乳球菌本身获得侵入细胞的能力，另外，新型质粒pV⁃alac也可在乳酸菌中进行表达，从而作为构建真核DNA疫苗的一种载体，该新型质粒由来自牛生长激素（BGH）中的聚腺苷酸化序列（polyA）和巨细胞病毒启动子（pCMV）两部分组成。Guimarães等将带有绿色荧光蛋白（GFP）的pValac质粒分别转染至PK15及Caco-2细胞中并得到相应的表达[25]。鉴于乳酸乳球菌没有定植能力，因此只能在黏膜水平上对蛋白质进行加工和传递[26]。同时使乳酸乳球菌在体内和体外均能将功能完整的质粒递送到真核细胞中[27]。怀着进一步提高乳酸菌的细胞侵入能力的目标，科学工作者们已在乳酸乳球菌中表达了外源蛋白Fn⁃BPA和InIA（产单核细胞内化蛋白），并通过体内试验和体外试验检测到FnBPA及InIA的表达情况，该研究结果表明外源侵入型蛋白的表达可有效增强乳酸菌的侵入能力，与表达FnBPA的乳酸菌菌株FnBPA+是体内传递质粒的最佳选择载体的研究结果吻合[28]。另外，研究表明，FnBPA或InIA的乳酸乳球菌不仅在体内的胃肠道中还在体外细胞中，都能提高质粒的转移效率[29]。乳杆菌属植物乳杆菌为乳酸菌中另一典型的菌种，定植于胃肠道，相较于乳酸乳球菌，其耐受胃酸和胆盐的能力更强，能更好地在消化道存活,且菌体自身具有较强的免疫刺激功效,该菌具有免疫调节和佐剂的特性[4,30]。研究表明，该植物乳杆菌能对医学上重要的蛋白质进行修饰，并能以多种方式对其进行表面锚定，基于乳酸菌能将cDNA递送到宿主细胞。Michon等为了提高植物乳杆菌递送DNA的能力，构建了表面锚定表达针对树突状细胞（DCs）表面的受体DEC-205的重组单链抗体（aDec）的植物乳杆菌，其特异性抗体在乳杆菌表面表达能增强乳杆菌对DC的靶向作用及结合能力，因而提高cDNA向DC的传递能力[31]。且在体外的细胞中或在体内的胃肠道中，重组单链抗体在菌种表面上的表达都能提高质粒由乳酸菌进入到树突状细胞的传递效率。

5 小结

乳酸菌作为DNA疫苗载体具有很好发展前景和研究价值，关于乳酸菌作为疫苗载体已有20多年发展历史，主要是使用乳酸菌作为外源蛋白载体对机体进行免疫，从而抵抗通过消化道和呼吸道黏膜进入体内的病原体，在乳酸菌中还有许多隐蔽性质粒存在，需要深入研究[32-33]。目前可用于构建疫苗的载体菌株仅限于乳酸球菌和乳酸杆菌属中的几个菌株,表达的抗原蛋白仅限于几种,构建成功的疫苗也不多，因此开发更多、更有效的疫苗载体株，构建更多、更有效的疫苗是今后的研究方向。