miR-34a通过下调SIRT1抑制乳腺癌干细胞机制研究*

李晓锋,汪园园，刘 希

西安交通大学第一附属医院病理科(西安710061)

乳腺癌对女性的伤害非常大，近年来乳腺癌的发生率一直在增加，对患者的生命造成了很大的压力[1]。在临床上乳腺癌的患者出现乳房肿块、胸痛、水肿、乳头内陷、乳头溢液以及乳头破碎等情况[2]，严重影响患者的生活质量和生命安全。miR-34a是一种肿瘤抑制因子，根据现在的研究发现miR-34a能够在胰腺癌干细胞，胃癌干细胞中发挥作用，但是在乳腺癌中是否能够发挥作用并不确定[3]。为了研究miR-34a通过下调SIRT1抑制乳腺癌干细胞的机制研究，本文中通过合成miR-34a的mimics或者inhibitors，并制成慢病毒的载体，从而改变SIRT1的蛋白质的表达，达到抑制乳腺癌细胞发展的作用。

材料与方法

1 材 料

1.1 质粒，细胞系，病毒：其中慢病毒载体，质粒均是从 Genepharma公司购买的，人乳腺癌细胞株MCF细胞是本实验中保存的。

1.2 实验仪器和器材： 其中有CO2培养箱(Thermo公司)，超净工作台，Mx300P荧光PCR仪(吉泰生物科技有效公司)，PCR管，8联排PCR管(Axygen公司)。

1.3 实验试剂：使用的实验试剂(限制性内切酶，Hsa-miR-mimics，Hsa-miR-inhibitors等)均由Inwitrogen公司购买。

2 方 法

2.1 MCF-7的细胞培养：将冷冻封存在MCF-7细胞放入恒温水浴箱中，使其融化，离心，放入培养基中，放入CO2培养箱中，每隔2～3 d更换一次培养基。将对数生长期的细胞取出，并制成单细胞悬液。离心后去掉上清液，重新制成悬浮细胞，将细胞悬液放置在培养瓶中，放在CO2培养箱中培养。

2.2 miR-34a的mimics或者inhibitors转染MCF-7细胞：将干粉miR-34a的mimics或者inhibitors以及NC溶解于DEPC水中，严格按照说明书进行转染。

2.3 构建稳定的miR-34a的慢病毒载体：使miR-34a的基因片段获得引物，并实行PCR扩增，对扩增的产物进行酶切。将PCR的产物连接线性化的质粒，制成感受态的细胞，之后实行转化。将其中的阳性克隆挑选出来，并进行PCR测定，之后进行测序。本实验中共转染293T的细胞，并且获得浓缩的病毒，实行滴定测定。

2.4 miR-34a的慢病毒载体感染MCF-7细胞：取出对数生长期的MCF-7细胞铺平放在孔板中，分别将0、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2μg/ml的浓度放置在孔板中，每2天更换新的培养液，使用显微镜观察细胞的死亡的情况，取出1周后完全死亡的浓度为最低的抑制浓度。根据说明书确定感染的最佳复数和感染的条件。使用miR-34a的慢病毒载体大量感染MCF-7细胞，感染后24h加入最低的抑制浓度0.4μg/ml的puromycin。收获具有抗性的细胞并提取RNA鉴定。

2.5 shRNA-SIRT1的表达载体的建立：在人的SIRT1的基因序列中选取4个位点，分别设计shRNA。将shRNA模板实行退火，设置出shRNA-SIRT1-1，shRNA-SIRT1-2，shRNA-SIRT1-3，shRNA-SIRT1-4，shRNA-NC，shRNA-GAPDH。将pGPH1/GFP/Neo载体进行线性化，构建pGPH1/GFP/Neo-shRNA载体。每组中选取两个克隆委托上海英骏生物有效公司进行测序。

2.6 shRNA-SIRT1载体转染MCF-7细胞：将G418的最低的抑制浓度筛选出来，在转染前1 d，将对数生长期中细胞接种在培养基(不含抗生素)中。取SIRT1质粒(4μg)，放入培养基(250μl Opti-MEMI)中，取lipofectamine2000(4μg)放入培养基(250μl Opti-MEMI)中，将上两步中的结果混合，放置在温室中孵育。将转染的混合液放入各孔中，放置在CO2培养箱中，使用具有抗生素抗性的细胞继续使用含有G418的培养基培养。获得细胞RNA和蛋白质。

3 统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件，计量资料采用(均数±标准差)的方式表示，两组间的比较采用t检验，治疗前后数据的比较采用配对t检验;计数资料采用频数和百分比表示，组间差异采用χ2检验，认为P<0．05时，差异具有统计学意义。

结 果

通过miR-34a的mimics转染的细胞的miR-34a的基因的表达水平大于没有转染的细胞，通过miR-34a的inhibitors转染的细胞的miR-34a的基因的表达水平小于没有转染的细胞，差异具有统计学意义(P<0.05)。LV-miR-34a感染细胞可以上调miR-34a的表达，与没有转染的细胞相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。shRNA-SIRT1-3组和shRNA-SIRT1-4组中的SIRT1中的mRNA和蛋白的表达出现下降的情况。过表达的miR-34a对SIRT1中的mRNA的表达没有影响。miR-34a的mimics具有抑制SIRT1的蛋白表达的作用，miR-34a的inhibitors具有上调SIRT1的蛋白表达的作用，与没有转染的乳腺癌的MCF-7的细胞相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。模拟物与抑制剂对miR-34a的基因表达的作用，在mimics转染的细胞中表达为20±2.5，在inhibitors转染的细胞表达为0.51±0.31，没有转染的细胞为正常表达水平1.0。

讨 论

现在随着分子生物学的快速发展，人们已经认识到肿瘤是与基因相关的一种疾病。癌基因的激活与抑癌基因的一个失活均可以导致细胞能够更好地逃避机体的调控，出现细胞的增殖异常、凋亡、侵袭与转移增强等一些现象。乳腺癌在女性中是一种常见的恶性肿瘤，目前随着临床诊疗技术的提高，早期的一个手术切除结合放疗与化疗的手段能帮助大部分乳腺癌病人取得了比较好的临床治疗效果。女性肿瘤中乳腺癌还是死亡的主要原因，一旦肿瘤发生转移，患者的预后比较差[4]。 miRNA是一种小分子的非编码的RNA，根据研究发现，miRNA是一种生物学的标记，可以应用于靶向的肿瘤治疗[5]。miRNA的活性与其和靶基因miRNA的可结合性密切相关，针对靶基因的不同序列，miRNA的抑制作用差异很大[6]。miR-34a广泛存在各种真核生物中，miR-34a在细胞中起到诱导细胞周期阻滞、抑制细胞侵袭转移和促进细胞衰老等多种功能。研究显示miR-34a是p53的直接靶基因，过表达的miR-34a可以诱导细胞出现凋亡以及细胞周期的停滞[7]。因此，miR-34a可以抑制肿瘤的基因的表达。在结肠癌中，miR-34a可以通过调控SIRT1的表达从而促进肿瘤细胞的凋亡[8]。现在可以通过模拟物以及抑制剂控制miR-34a的表达，通过慢病毒的载体携带miR-34a基因感染细胞，从而导致miR-34a基因在细胞中表达[9]。病毒中的miR-34a基因可以随着细胞的复制而复制，从而在细胞中稳定的表达。巩雅宁等[10]研究的人乳腺癌组织中miR-34a的表达及其在乳腺癌细胞系中的功能研究的研究结果与本文结果具有一致性，说明本文研究结果具有一定的可信性。

本研究miR-34a通过下调SIRT1抑制乳腺癌干细胞的机制，使用化学合成的方法合成出miR-34a的mimics或者inhibitors，将其感染乳腺癌的MCF-7的细胞[11]，通过qRT-PCR的方法验证miR-34a的基因的表达。以慢病毒作为载体过表达miR-34a的基因，将能够稳定感染的细胞株筛选出来。设计SIRI1基因中的shRNA,用于干扰乳腺癌的MCF-7的细胞中的SIRT1的表达[12]。使用qRT-PCR方法和Western blotting技术检测SIRT1中的mRNA和蛋白的表达。

综上所述，使用miR-34a的模拟物以及抑制物可以调节miR-34a的表达，从而改变SIRT1的蛋白质的表达，其中shRNA-SIRT1-3，shRNA-SIRT1-4具有良好的干扰效果。

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