羊肚菌化学成分分析与对羟基苯甲醇的含量测定＊

李 湜，汪鋆植,3＊＊，张 盼，刘兰庆，李平媛，邓改改，贺海波,2

（1.三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室 宜昌 443002；2.湖北省土家族医药研究所 宜昌 443002；3.湖北省生物酵素工程技术研究中心 宜昌 443002）

羊肚菌，又名羊肚蘑、编笠菌，来源于羊肚菌科Morchellaceae羊肚菌 Morchella esculenta （L.）Pers的子实体[1]。因其菌盖凹凸不平、状如羊肚而名。羊肚菌是一种珍贵的食、药用菌，具有较高的药用和食用价值。我国对羊肚菌的记载最早见于《本草纲目》[2]，其菜部蘑菰蕈纲目记载：一种状如羊肚，有蜂窠眼者，名羊肚菜。现代本草专著《中华本草》[3]及《新华本草纲要》对羊肚菌药理作用有详细论述，其味甘，性平。有和胃消食，化痰理气的功能。用于消化不良、痰多气短。

羊肚菌属共有28个种，分布于世界各地，在我国主产于甘肃、湖南、青海、云南、新疆、四川、山西等地。羊肚菌肉质脆嫩鲜美，营养丰富，是一种珍稀的食、药两用真菌，有“素中之荤”的美称。近年来，羊肚菌受到了国内外学者的广泛重视，研究内容主要涉及资源种类，地理分布，生长环境，栽培技术，化学成分及药理活性。现代医学研究表明，羊肚菌的蛋白质和氨基酸含量丰富，不饱和脂肪酸含量非常高。羊肚菌的蛋白质含量比木耳多1倍，所含氨基酸中人体所需8种必需氨基酸占总量的47.47%[4]。羊肚菌蛋白质具有葡聚糖裂解酶[5]和脂氧合酶活性[6]以及抑制血小板聚集等多种作用，是营养和功能性食品开发的良好基料。而且其蛋白溶液有一定的抗氧化能力，对DPPH自由基的清除作用良好，与VC相近[7]。同时羊肚菌矿物元素含量丰富、种类齐全，含人体必需的钾、磷、钙等常量元素很高，人体必需的微量元素Fe，Mn，Zn等也很高。这些矿质元素中Zn的含量是最高的[8]，Zn是人体必需的微量元素，能促进人体生长发育和增强人体免疫机能，食品中以游离态存在的锌不易被人体吸收，且一般游离态的金属均具有一定毒性。利用真菌富集功能，将无机锌与蛋白、糖等物质结合成有机锌蛋白和锌多糖等大分子活性物质。而羊肚菌菌丝体具有较强的耐锌能力和富锌能力[9]。羊肚菌中硒元素含量较为丰富，高达5.16 mg⋅kg-1[10]。硒是人体红细胞谷胱甘肽过氧化酶的组成成分，可运输大量氧分子用来抑制恶性肿瘤，使癌细胞失活；另一方面能加强维生素E的抗氧化作用[11]。羊肚菌所含的多糖成分也具有很高的药用价值，具有升高白细胞的数量、提高免疫功能、抗癌、抗菌、预防艾滋病等多种功效。除此之外，研究表明羊肚菌提取物具有抗癌、降低毒性肾损伤、抗实验型胃溃疡等活性。因此，羊肚菌在食品药品领域具有极大的开发潜力和广阔的应用前景。

近年来国内、外对羊肚菌成份的报道较多地是营养成分,主要集中在多糖、酶类、氨基酸、吡喃酮抗生素、脂肪酸类等几个大的方面，对活性单体成分的研究鲜有报道，在一定程度上限制了羊肚菌的开发应用。鉴于上述原因，研究并探索羊肚菌子实体的化学成分十分必要。明确羊肚菌有效成分和有效部位，为更好地体现其药用价值，促进羊肚菌的利用，都具有十分重要的意义。本实验针对羊肚菌的成分进行了分离、纯化和结构鉴定，确定活性化合物，并采用HPLC法对主要活性成分含量进行测定，为进一步开发利用羊肚菌奠定基础。

1 仪器与材料

1.1 仪器

HEV-50型自动灭菌锅（日本HIRAYAMA公司）；Bruker AV 400核磁共振波谱仪（瑞士布鲁克公司）；SB-100旋转蒸发仪（日本EYELA公司）；DIONEX 3000液相色谱仪（美国Thermo公司）；Cosmail C18（4.6 mm×250 mm）色谱柱（日本NACALAI TESQUE,INC）；低温冷冻干燥机（美国Labconco公司）。

1.2 材料

0.45 μm尼龙膜针筒过滤器（天津津腾）；薄层色谱板（烟台市化学工业研究所）；甲醇（色谱纯，美国Thermo公司）；其它试剂均为分析纯（天津科密欧试剂）；羊肚菌子实体，由宜昌市农科院提供，经刘世林研究员鉴定为羊肚菌Morchella esculenta （L.）Pers。

2 方法与结果

2.1 提取与分离

羊肚菌新鲜子实体干燥粉碎后得到0.8 kg的粉末，用3 L95%的乙醇于热水浴中提取3次，每次3 h。乙醇提取液减压浓缩至无醇味，使用纯水溶解醇提物浸膏，并使用1∶1的石油醚多次萃取，直至石油醚层无明显颜色，得到石油醚提取物，然后使用乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯提取物，最后再用正丁醇萃取后得到正丁醇提取物。石油醚萃取物浸膏经硅胶柱层析，以石油醚-乙酸乙酯（1∶0-0∶1，V/V）进行梯度洗脱得到4部分（Fr.1-Fr.4），再经硅胶柱（石油醚-乙酸乙酯（3∶1））层析分离纯化得到化合物1、2。乙酸乙酯萃取物浸膏经硅胶柱层析，以氯仿-甲醇（1∶0-0∶1，V/V）进行梯度洗脱，后经1次凝胶柱（氯仿-甲醇（1∶1））层析分离纯化得化合物3、4。正丁醇部位用水饱和的正丁醇做洗脱剂，制备得到化合物5。

2.2 结构鉴定

通过核磁鉴定，分离得到的五个单体化合物分别为11,15,19-三甲基-5,9,-二十碳二烯酸（11,15,19-trimethyl-5,9-eicosadienoic acid）[12]、顺-13-二十二碳烯酸（cis-13-Docosenoic acid&Erucic acid）[13]、对羟基苯甲醇（4-Hydroxybenzyl alcohol）[14]、5,7,22-三烯-3β-羟基-麦角甾醇（Ergosta-5,7,22-triene-3β-ol）[15]和甘露醇（Mannitol）[16]，结构式（图1-5）。

11,15,19 -三甲基-5,9,-二十碳二烯酸:1H NMR（400 MHz,CDCl3）δ：5.43 （2H,m）,5.36 （1H,m）,5.25（1H,m）,2.25 （4H,m）,2.10 （1H,m）,2.03 （3H,m）,1.69（3H,m）,1.54 （1H,m）,1.31 （5H,m）,1.13 （8H,m）,0.89（12H,m）;13C-NMR （100 MHz，CDCl3）δ：179.49 （C-1）,33.953 （C-2）,24.683 （C-3）,27.171 （C-4）,130.018 （C-5）,128.061 （C-6）,29.021 （C-7）,29.062 （C-8）,127.897（C-9）,130.439 （C-10）,31.913 （C-11）,31.913 （C-12）,29.127 （C-13）,29.334 （C-14）,31.516 （C-15）,29.343（C-16）,31.516 （C-17）,29.575 （C-18）,29.678 （C-19）,22.499 （C-20）,14.043 （C-21）,14.095 （C-22）,22.555 （C-23）。

图1 11,15,19-三甲基-5,9,-二十碳二烯酸

图2 顺-13-二十二碳烯酸

顺-13-二十二碳烯酸：1H NMR （400MHz,CDCl3）δ：5.79 （1H,br.s,OH）,5.35 （2H,t,J=5.1Hz）,2.29 （2H,t,J=7.5 Hz,CH2COOH）,1.95 （2H,H-15）,1.95 （2H,H-12）,1.29 （CH2）,0.88 （3H,t,J=6.9 Hz）;13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：179.935 （C-1）,129.713 （C-13）,129.92 （C-14）,34.03 （C-2）,31.91 （C-20）,29.76 （C-11）,29.67 （C-16）,29.58 （C-18）,29.51 （C-19）,29.57 （C-42）,29.35 （C-5）,29.31 （C-6）,29.23 （C-7）,29.13 （C-8）,29.06 （C-11）,29.02 （C-17）,27.20 （C-12）,27.10 （C-15）,24.67（C-3）,22.68 （C-21）,14.11 （C-22）。

对羟基苯甲醇：1H NMR （400 MHz,CD3OD）δ：7.16（2H,d,J=11.48 Hz）,6.75 （2H,d,J=11.44 Hz）,4.87 （s,2H）,4.48 （s,2H）;13C-NMR （100 MHz,CD3OD）δ：155.483 （C-1）,129.532 （C-4）,129.745 （C-3,-5）,115.0（C-2,6）,62.67（-CH2）。

5,7,22 -三烯-3β-羟基-麦角甾醇：1H NMR（400MHz,CDCl3）δ：5.57 （3H,d,J=3.6Hz）,5.52-5.15（10H,m）,5.13 （1H,s）,3.63 （4H,d,J=4.2Hz）,2.46 （2H,s）,2.28 （2H,s）,1.25-1.05 （6H,m）,1.09-0.67 （9H,m）,063 （7H,s）;13C-NMR （100MHz,CDCl3）δ：37.024 （C-1）,31.944 （C-2）,70.464 （C-3）,40.409 （C-4）,139.75 （C-5）,119.585 （C-6）,116.282 （C-7）,141.355 （C-8）,46.249（C-9）,36.9 （C-10）,21.104 （C-11）,38.371 （C-12）,40.795 （C-13）,54.555 （C-14）,22.99 （C-15）,28.277 （C-16）,55.734 （C-17）,12.041 （C-18）,16.278 （C-19）,39.08（C-20）,21.02 （C-21）,135.56 （C-22）,131.976 （C-23）,42.817 （C-24）,33.084 （C-25）,19.637 （C-26）,19.944（C-27）,17.597 （C-28）。

甘露醇：1HNMR （400MHz,CDCl3）δ：3.75 （2H,dd,H-1b,H-6b）,3.57 （2H,d,J=8.65Hz,H-3,H-4）,3.54（2H,dd,H-1a,H-6a）,3.22 （2H,dd,H-2,H-5）;13CNMR（100MHz,CDCl3）δ：63.80 （C-1,6）,69.66 （C-2,5）,71.23 （C-3,4）。

2.3 羊肚菌中对羟基苯甲醇的HPLC含量测定

2.3.1 色谱条件

使用Cosmail C18（4.6 mm×250 mm）色谱柱，流动相为甲醇：水=10%∶90%，DAD检测器设定检测波长为220 nm，柱温为25℃，进样量为10 μL，洗脱程序为恒梯度洗脱10 min。

图3 对羟基苯甲醇

图4 5,7,22-三烯-3β-羟基-麦角甾醇

图5 甘露醇

2.3.2 对照品溶液的制备

精密称取对羟基苯甲醇标准品5 mg，置于5 mL棕色容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，配置成1 mg⋅mL-1的对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备

精密称取羊肚菌样品粉末（过3号筛）约1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入50%乙醇50 mL，称定质量，超声处理，放冷，再称定质量，用50%乙醇补足减失的质量，滤过，精密量取续滤液10 mL，浓缩至近干无醇味，使用1 mL甲醇超声处理10 min溶解后，再用0.45 μm有机膜滤头过滤。

2.3.4 线性关系考察

图6 对羟基苯甲醇的标准曲线

表1 不同产地羊肚菌和不同碳源培养的菌丝体中对羟基苯甲醇的含量

精密称取对羟基苯甲醇对照品适量，然后色谱甲醇精密稀释成0.8 mg⋅mL-1、0.6 mg⋅mL-1、0.4 mg⋅mL-1、0.2 mg⋅mL-1、0.1 mg⋅mL-1、0.05 mg⋅mL-1、0.01 mg⋅mL-1和0.001 mg⋅mL-1对照品溶液，使用0.45 μm有机膜滤头过滤后待用。按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，绘制标准曲线，得回归方程Y=217.95X-0.003，相关系数R2=0.999。由图5可知，羊肚菌的质量浓度在0.01-0.8 mg⋅mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.3.5 精密度试验

取对照品溶液适量，按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，重复6次，记录峰面积。结果，RSD＝1.06%（n＝6），表明仪器精密度良好。

2.3.6 重复性试验

取本品适量，按“2.3.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，再按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，RSD＝0.96%（n＝6），表明本方法重复性良好。

2.3.7 稳定性试验

取同一供试品溶液适量，分别于放置0、2、4、6、8、10、12、24、36、48 h时按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，RSD＝0.99%（n＝10），表明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.3.8 加样回收率试验

精密称取已知对羟基苯甲醇含量的羊肚菌粉末6份，分别精密加入对羟基苯甲醇标准品溶液，按“2.3.3”项下方法制成供试品溶液，再按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积，平均回收率为98.27%，RSD＝1.84%（n＝ 6）。

2.3.9 样品含量测定

取不同产品的羊肚菌子实体，以及土豆培养基中分别等量加入可溶性淀粉（A）、玉米汁（B）、小麦汁（C）液体发酵培养的三种菌丝体，按“2.3.3”项下方法制备供试品溶液，再按“2.3.1”项下色谱条件进样测定，各进样10 μL，测定2次，根据回归方程计算样品中对羟基苯甲醇的含量，结果（表1）。

3 讨论与结论

羊肚菌富含多糖、蛋白质、黄酮类、多酚类、氨基酸以及微量元素等成分，不仅味美，具有极高的营养价值，还具有多种保健功能。现代研究表明羊肚菌有调节免疫[17]、保肝护肾[18]、抗疲劳[19]、抗衰老[20]、抗肿瘤[21]、降血脂[22]等多种作用。羊肚菌所含的亚油酸和油酸有降低人体胆固醇浓度和降低低密度脂蛋白（LDL），升高高密度脂蛋白（HDL）的功能，有助于预防动脉硬化[23]；羊肚菌多糖具有降血脂，增强免疫功能，抗疲劳、预防动脉硬化的作用，并能减轻癌症患者放化疗引起的毒副作用[24]；黄酮、多酚类、核苷酸等物质则具有抗氧化抗肿瘤、预防、治疗佝偻病和机体各种黏膜炎及皮肤炎等功效。

但对羊肚菌活性成分的研究还有待深入，既往多项活性的研究，还停留在提取物上，未对羊肚菌提取物中具体保护心血管系统的成分详细分析报道。Tomita等[25]从羊肚菌子实体中提取出具有抗血小板凝集作用的物质，其效果比阿斯匹林高出2-3倍，能有效地防治心脑血管血栓的形成。王亚辉等[26]通过建立大鼠高血压模型后给药尖顶羊肚菌子实体提取液，发现羊肚菌提取液显著降低了模型大鼠的收缩压。梅晓灯[27]等发现，低、高剂量组尖顶羊肚菌活性提取物能显著地抑制高血压大鼠的收缩压升高，这说明羊肚菌提取物具有良好的降血压作用。诸多的证据显示羊肚菌在保护心血管方面的作用价值，其组成成分中也必然存在发挥作用的物质基础，故有必要进一步对羊肚菌保护心血管系统的活性成分深入研究。

研究表明对羟基苯甲醇（4-hydroxybenzylalcohol，4-HBA）是羊肚菌的活性成分之一。对羟基苯甲醇具有多种作用，是天麻的主要活性成分之一，与天麻的抗惊厥、保护心脑血管及神经细胞、改善学习记忆等作用有关[28]。对羟基苯甲醇在体外、体内均具有显著的抗血小板聚集活性，其作用机制可能是通过抑制外钙内流和内钙释放达到抑制血小板聚集作用[29]。血小板的活化、聚集是动脉粥样硬化、心肌梗死、中风等多种心脑血管疾病的重要发病机制之一，因此，对羟基苯甲醇可能是羊肚菌防治心血管疾病的物质基础之一。

中医之“痰”与多种疾病具有密切的关系，有“广义”和“狭义”之分。狭义之痰，一般是指肉眼可见之痰，又称为“外痰”。广义之痰，泛指因气化失常产生、遍布周身内外的，具有广泛致病性的病理代谢产物。又称之为“内痰”。“内痰”致病广泛，出现眩晕、头身困重、肥胖、气短、嗜睡、纳呆、恶心、舌淡、苔腻、脉濡滑等多种症状。是高血压、治冠心病、脑卒中、血管性痴呆等心脑血管疾病；高脂血症、脂肪肝、糖尿病等代谢性疾病的危险因素。因此，从痰论治是中医治疗多种疾病的方法。具体治法有益气化痰、温阳化痰、解郁化痰、清热化痰、温化寒痰、燥湿化痰、润燥化痰、祛风化痰、消积化痰、化痰散结、化痰开窍等。中医认为“脾为生痰之源”，在治痰的过程中，十分注重脾胃功能的调理恢复，在治痰的过程中常酌选补气、理气药。羊肚菌既能补益脾胃，又能化痰理气，对治疗“痰”证具有重要意义。本研究为进一步研究阐释羊肚菌化痰理气等传统功效的物质基础和现代医学机制提供了依据。

由表1可知，对3个不同产地羊肚菌子实体以及不同培养基液体发酵培养的羊肚菌菌丝体中对羟基苯甲醇含量进行了测定，发现不同产地，相同培养方式生产的羊肚菌子实体中对羟基苯甲醇含量差异较小，不同培养条件生产的的菌丝体中对羟基苯甲醇含量差异较大。对羟基苯甲醇在羊肚菌中含量较高，药理作用明确，且与其活性相关联，因此，对羟基苯甲醇可作为羊肚菌质量控制标准之一。本研究所建立的含量测定指标及方法可为羊肚菌的质量控制提供参考。

同时，甘露醇具有利尿脱水、提高血浆渗透压、抗氧化、抗衰老、镇咳、祛痰和平喘等多种功效[30,31]，是虫草及其制品中重要的功能性成分之一[32]，也是评价虫草及其制品质量品质的重要指标[33]，其测定方法已经收载于中国药典。因此，甘露醇可以同对羟基苯甲醇同时作为羊肚菌的质量控制指标，以期更好控制羊肚菌的质量。