增强耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗生素敏感性的中药筛选＊

鲁 茹，陆桂玉，林浙哲，郑洪杰，程东庆

（浙江中医药大学医学技术学院 杭州 310053）

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA）是含有外源性甲氧西林耐药决定子（methicillin-resistant determinant A，MecA）或者苯唑西林最小抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration，MIC）≥ 4 μg·mL-1的金黄色葡萄球菌菌株，是许多国家最常见的导致医院获得性感染的病原体，也是WHO发布的三种最重要的超级耐药菌之一，能导致坏死性肺炎、严重败血症、坏死性筋膜炎等疾病[1,2]，严重危害人体健康，据估计每年大约有十万人因感染MRSA而住院治疗，其防治已成为全球关注的焦点。MRSA除对甲氧西林耐药外，对其它所有与甲氧西林相同结构的β-内酰胺类和头孢类抗生素均耐药，它还可通过改变抗生素作用靶位，产生修饰酶，降低膜通透性产生大量PABA等不同机制[3]，对氨基糖苷类、大环内酯类、四环素类、氟喹喏酮类、磺胺类、利福平均产生不同程度的耐药。我国MRSA分离株对庆大霉素、克林霉素、大环内酯类和左氧氟沙星等抗菌药物的耐药率基本上都在80%左右[4]，且分离率及多重耐药呈增加趋势[5]。目前，可供临床治疗MRSA的药物非常有限，除传统的糖肽类抗生素如万古霉素，及新研发的抗生素如利奈唑胺及达托霉素外，其他抗生素的效果均不佳。万古霉素是治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌感染的常见药物。但随着万古霉素的广泛应用，降低了MRSA对万古霉素的敏感性，且万古霉素对组织穿透能力有限，其在体外对MRSA的杀菌作用明显慢于β内酰胺类，治疗MRSA菌血症和感染性心内膜炎方面的疗效显著低于β内酰胺类，杀菌速度比较缓慢，虽MRSA对万古霉素敏感率相对较高，但临床效果欠佳[6]。且万古霉素具有严重的耳毒性及肾毒性，因此临床应用受到了较大的限制[7]。目前许多国家（包括中国）均已发现对万古霉素耐药的MRSA[8]，若耐万古霉素的MRSA广泛感染，就目前状况而言无药可救，因此MRSA已成为临床和公共卫生的公敌，其防治已成为全球关注的焦点。在耐万古霉素的MRSA广泛感染之前，寻找有效抗MRSA的药物迫在眉睫。

而中药能够作为抗菌增敏剂能够增强耐药菌对抗生素的敏感性，且至今未发现中药耐药菌。以天然活性产物为先导的抗MRSA药物研究已有一定历史，目前中药逆转耐药机制作为中药抗菌研究的一个新的领域已经悄然兴起，并且取得了不少成就。从MRSA的耐药机制角度出发，一些中药虽不能够直接杀菌，但能够从不同方面增强MRSA抗生素敏感性，从而为抗生素杀菌打开MRSA耐药的束缚。此时，进行中西药联用，筛选出有增敏作用的中药，使其天然活性成分对细菌进行结构修饰，达到更好的抗菌效果，增加对抗生素的敏感性是目前研究的热点。

本文选取33种常用中药制备提取物，作用于临床分离的MRSA菌株，考察中药作用前后MRSA对苯唑西林（美国临床和实验室标准协会CLSI建议对苯唑西林MIC≥4 μg·mL-1的金黄色葡萄球菌菌株定义为MRSA）敏感性的变化，旨在筛选能增强MRSA抗生素敏感性的中药，探索此类中药与抗生素配伍使用恢复抗生素的杀菌效力的可行性，为临床治疗MRSA感染提供新思路。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

MRSA（271）经浙江大学医学院附属第一医院检验科分离、鉴定、惠赠；本实验室保存的对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌ATCC25923用于质控。

1.2 材料

中药：穿心莲（广东）、浙贝母（浙江）、槐花（河北）、射干（安徽）、毛冬青（浙江）、芦荟（海南）、牡丹皮（安徽）、水飞蓟（江苏）、金银花（山东）、野菊花（安徽）、连翘（山西）、山楂（山东）、马齿苋（浙江）、天葵子（湖南）、青黛（福建）、白及（浙江）、鱼腥草（兴宁）、山核桃叶（浙江）、山楂核（安徽亳州）（均购自浙江中医药大学饮片厂），姜黄素（购自华东医药集团生物工程研究所有限公司）。

培养基：Luria-Bertani培养基，配方为蛋白胨2.50 g、Nacl 1.25 g、琼脂 3.75-5.00 g、牛肉膏 0.75 g、蒸馏水250 mL，调节PH为7.3 Ml；5.1倍MH肉汤，配方为可溶性淀粉0.38 g、NaCl 0.20 g、酸水解酪蛋白4.38 g、牛肉浸膏0.75 g、蒸馏水250 mL，调节PH至7.3 mL蛋白；2倍MH肉汤，配方为可溶性淀粉0.76 g、NaCl 0.20 g、酸水解酪蛋白8.76 g、牛肉浸膏1.50 g、蒸馏水250 mL，调节PH至7.3 mL蛋白。钙离子调节的MH肉汤培养基（CAMHB）是在MH的基础上加CaCl2，使其Ca2+浓度达到0.05 mg·mL-1（应用于苯唑西林需另加2%NaCl）。

1.3 仪器设备

II级生物安全柜（1300 SERIES A2，美国Thermo公司），细菌浊度仪（WGZ-2XJ，上海昕瑞仪器仪表有限公司），台式连续投料粉碎机（DF-20，温岭市大林仪器公司），电子精密天平（PL602E/02，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司），超低温冰箱（Thermo Scientific Forma 994），恒温电热套（TC-5，海宁市华星仪器厂），旋转蒸发仪（RE-52AA，上海亚索生化仪器厂），智能生化培养箱（SPX-280，宁波海曙赛福实验设备有限公司）等。

1.4 方法

1.4.1 水煎法制备中药提取液[9]

称取25.00 g中药，研磨切碎，加500 mL蒸馏水，文火煎30 min，过滤；滤渣加500 ml蒸馏水，重复操作，合并2次滤液并2000 r·min-1离心，上清液加热浓缩至25 mL，即得1.00 g·mL-1中药水提物。临用前用蒸馏水1∶100倍稀释，再用肉汤倍比稀释成6个浓度。

1.4.2 醇提法制备中药提取液[10]

称取25.00 g中药，加250 mL 95%乙醇，加热回流4 h，过滤，滤液2500 r·min-1离心，上清液旋蒸至干。用二甲基亚砜（DMSO）溶解中药醇提物制得母液，再加入生理盐水注溶。灭菌后用肉汤将其倍比稀释成6个浓度。

1.4.3 苯唑西林溶液制备[11]

取苯唑西林钠一水合物溶于蒸馏水，得5120 μg·mL-1浓度的苯唑西林母液。

临用前用CAMHB将苯唑西林母液稀释。

1.4.4 菌液制备[12]

将菌种接种于LB培养基中，于37℃生化培养箱中培养18-24 h，用生理盐水配制0.5麦氏浊度菌液，再用CAMHB稀释100倍，相当于菌液浓度为106CFU·mL-1。

1.4.5 中药作用前菌株对苯唑西林的MIC测定

参照CLSI 2017标准方法[11]，通过微量液体法：将倍比稀释后不同浓度的苯唑西林溶液分别加到96孔聚苯乙烯板中，每孔100 μL，设复孔。再在每孔中加100 μL所制得的菌液，最终药物浓度分别为1024、512、256、128、64、32 μg·mL-1。密封后置于34℃生化培养箱培养16-20 h后，观察各孔是否出现浑浊，以肉眼观察板条中不长菌的孔所对应的最低药物浓度为MIC。最终测定苯唑西林对MRSA（271）、ATCC25923的MIC。

1.4.6 菌株对中药提取物的MIC测定

采用微量肉汤稀释法，将倍比稀释后不同浓度的中药液分别加到96孔聚苯乙烯板中，每孔100 μL，设复孔。再在每孔中加100 μL所制得的菌液，密封后置于34℃生化培养箱培养16-20 h后，观察各孔是否出现浑浊，以肉眼观察板条中不长菌的孔所对应的最低药物浓度为MIC。颜色较深的孔可在LB平板上点种加以验证[13]。

1.4.7 中药提取物对苯唑西林MIC的影响作用

选取对实验菌株没有抑制作用的最大浓度作为各提取物的起始工作浓度，适当稀释后与MRSA新鲜培养物（106CFU·mL-1）共同培养，微量液体法测定苯唑西林的MIC，设阳性对照（只加菌液与肉汤）、阴性对照（只加肉汤），每一试验设2个复孔。34℃培养24 h，记录MIC。中药提取物作用前后苯唑西林的MIC经过对数变换后进行配对t检验[14,15]，判断中药提取物增敏作用实验前后MRSA（271）对苯唑西林的敏感性有无差异（P＜0.05为差异有统计学意义）。

1.4.8 有效中药提取物的量效关系的确定

选出具有增敏作用中药，以增敏实验时的有效浓度为起始浓度，进行10%梯度稀释。在96孔聚苯乙烯板中横排从左向右依次加50 μL倍比稀释的苯唑西林溶液（2048、1024、512、256、128、64 μg·mL-1）。竖排从上向下依次加50 μL10%梯度稀释的中药稀释液，再在每孔中加入100 μL所制得的菌液，做复孔。密封后置于34℃生化培养箱培养16-20 h后，观察各孔是否出现浑浊，以肉眼观察板条中不长菌的孔所对应的最低药物浓度为MIC，记录中药作用前后MIC，以MIC降低率（式1）为判断指标，选出中药有效浓度范围。

2 结果与分析

2.1 菌种耐药性测定结果

根据美国临床实验室标准化委员会标准规范，MIC ≥ 4 μg·mL-1为耐药，MIC ≤ 2 μg·mL-1为敏感，参照CLSI 2017标准方法[11]，测得苯唑西林对MRSA（271）的MIC 为 128-512 μg·mL-1，为 耐 药 菌 ；对 MSSA（ATCC25923）的MIC为0.25 μg·mL-1，为敏感菌，用于质控。

2.2 增敏作用实验结果

所选的33种提取物中测得13种中药提取物对MRSA（271）的MIC为：连翘醇提物14.0 mg·mL-1，马齿苋醇提物320.5 mg·mL-1，鱼腥草醇提物140.5 mg·mL-1，射干醇提物283.5 mg·mL-1，野菊花醇提物224.0 mg·mL-1，槐花醇提物 240.0 mg·mL-1，牡丹皮醇提物48.3 mg·mL-1，水飞蓟醇提物129.0 mg·mL-1，青黛醇提物1078.0 mg·mL-1，芦荟醇提物18.3 mg·mL-1，毛冬青醇提物 17.1 mg·mL-1，山楂醇提物 66.5 mg·mL-1，白及醇提物78.0 mg·mL-1。其余20种中药提取物在实验中未测得MIC，对MRSA（271）无抑制作用。

为排除增敏作用实验时中药本身抑菌作用对实验结果的影响，选取中药提取物对实验菌株没有抑制作用时的最大浓度作为各提取物的起始工作浓度。总共进行三次重复实验，以中药提取物作用前后苯唑西林MIC的改变为指标，根据不同中药提取物各自对MRSA（271）的增敏作用实验前后苯唑西林MIC的变化，采用配对t检验（P＜0.05为差异有统计学意义），判断中药提取物增敏作用实验前后MRSA（271）对苯唑西林的敏感性有无差异，即中药提取物对MRSA（271）是否具有增敏作用。

研究中药增强细菌对抗生素敏感性的作用，发现白及醇提物能够降低MIC（P＜0.05），即白及醇提物能够增强MRSA（271）对苯唑西林的敏感性（表1）。

2.3 增敏中药提取物的量效关系

选取具有增敏作用的白及醇提物为对象，采用10%梯度稀释法，使白及醇提物浓度为39.0、37.0、35.1、33.2、31.2、29.2、27.3、25.4、23.4、21.4、19.5 mg·mL-1，确定其增敏作用的有效浓度范围（该实验中，苯唑西林单独作用时MIC为256 μg·mL-1。）。MIC降低率为12.5%时白及醇提物浓度为25.4-31.2 mg·mL-1；MIC降低率为25%时白及醇提物浓度为31.2-39.0 mg·mL-1（图1）。则白及醇提物的有效浓度范围为25.4-39.0 mg·mL-1（图1）。

3 讨论

由于抗生素的广泛使用，细菌广谱耐药现象十分严重。2016年9月5日，二十国集团（G20）领导人杭州峰会通过的《二十国集团领导人杭州峰会公报》将抗生素耐药性话题上升到了国际高度，使之成为一个等同于气候变化和恐怖主义的世界性挑战问题[16]。目前我国细菌耐药性问题尤为严重，已高于世界平均水平的30%，且有逐年上升趋势[17]。MRSA能导致坏死性肺炎、严重败血症、坏死性筋膜炎等疾病[1,2]，严重危害人体健康，早在1959年Jevons在英国就首次发现MRSA。当前，MRSA感染正以医院获得性感染的方式向社区获得性感染的形式蔓延，特别是新的MRSA菌株极快地促进了其在全球扩散的速度，已成为医院内和社区感染的重要病原菌之一[18]。在澳大利亚、东南亚、南欧等一些国家和地区检出率可达25%-50%[19]。在美国，每年因MRSA感染导致死亡的患者数相当于AIDS、结核病和病毒性肝炎的总和[20,21]。2004年美国大部分医院MRSA感染率都超过50%，MRSA在美国占院内感染金葡菌的比率从1975年的2.4%上升到1997年的39.9%。2005年，美国Uehnert等在全美475所医院的调查显示，MRSA感染的住院病人相比1995年增长了10倍，是2000年的3倍，比2004年增长了30%，而且由于检测及培养方面的差别与缺陷，实际的发生率可能更高[22]，其中北美和南美这些地区是全球检出率最高的地方已超过50%[19]。美国CDC发言人称，MRSA的发病率和死亡率超过艾滋病、SARS和禽流感。2005年，在美国，MRSA严重感染人数约为9.4万人，死亡1.865万人，而当年艾滋病的死亡人数是1.7万左右，所以MRSA又被称为是“超级细菌”[23]。在我国，大型教学医院MRSA的检出率也达到60%[24]，MRSA分离率及多重耐药均有增加趋势。2008年Mohnarin监测资料显示，综合医院MRSA分离株占金黄色葡萄球菌的67.6%、ICU中高达84.8%。据估计每年大约有十万人因感染MRSA而住院治疗。我国虽尚无MRSA感染率及死亡率的全国性数据，但MRSA分离率及多重耐药均有增加趋势。据对多重耐药菌的调查发现[25]，MRSA依然为我国细菌耐药研究重点之一。

表1 中药提取物作用前后苯唑西林对MRSA（271）的MIC结果

图1 白及醇提物10%梯度稀释量效关系图

MRSA的耐药机制主要为产生对β-内酰胺类抗生素亲和力很低的PBP2a；产生β-内酰胺酶；增强细菌主动外排系统，减少抗生素在菌体内积聚等。MRSA的多种耐药机制使敏感菌成为耐药菌，为临床治疗带来困难，有效药的缺少与病症感染的增多使抗耐药菌新药的开发成为必然。因此寻找研发新型药物已成为耐药菌防治研究的重点。

MRSA的多种耐药机制造成目前抗生素抗MRSA效果甚微。随着近几年中西医结合工作的深入开展，中西药的联合应用引起国内外学者的广泛重视。中药具有多组分、多层面、多靶点、毒副作用小、很少发生耐药现象等特点[26]，另外多活性成分发挥药效作用，调动机体自身的抗病能力，达到多效性和整体的调节作用；西药多为化学单体，组成成分明确，作用靶点具有专一性和针对性，其作用机理相对中药比较清楚，疗效评价体系比较容易明确[27]。目前国内研究已发现中药可以通过破坏细菌细胞结构，抑制生物膜形成，抑制细菌蛋白合成等进行抑菌。还可以通过消除R质粒、抑制细菌主动外排泵、抑制β-内酰胺酶、抑制耐药基因的表达等途径逆转细菌耐药性[28]。韦志友等人[29]发现β-内酰胺酶抑制剂的抗菌活性极弱，但对β-内酰胺酶的抑制作用却很强。临床常与相应的抗生素联合使用而起协同作用。这是因为它们在抑制了β-内酰胺酶的同时，还保留了抗生素的抗菌活性，从而有效对抗细菌的耐药性。临床实践证明，中西药的合理联用确实可以发挥其各自优势，取得优于单独使用中药或西药的综合疗效，减少药物的用量，或扩大药物的适应范围，这是中西药联用的潜在优势。现中药已逐渐成为抗耐药菌研究的热点。目前已有研究表明某些中药具有抗菌增敏作用，如大蒜素、川芎嗪[30]、黄藤素、没子酸[13]等，可以提高细菌对抗生素的敏感性，甚至是逆转细菌耐药性，提升已有抗生素的作用。这为解决日趋严重的细菌耐药性问题提供了新思路。本实验以中药提取物整体为对象，增加筛选到有效物的可能性，使中药发挥减缓或消除细菌耐药性的作用，而西药发挥抑菌杀菌作用，达到更好抗菌目的。

本实验通过筛选33种中药提取物的增敏作用，最终发现白及醇提物能够有效降低苯唑西林对MRSA（271）的MIC（P ＜ 0.05），增加MRSA（271）对苯唑西林敏感性。并通过实验确定了白及醇提物的量效关系：当白及醇提物浓度为25.4-31.2 mg·mL-1时，其MIC降低率为12.5%；当白及醇提物浓度为31.2-39.0 mg·mL-1时，MIC降低率为25%。并最终确定其有效浓度范围为25.4-39.0 mg·mL-1。本次实验成功地筛选出了具有增敏作用的中药提取物，即白及醇提物，但是，白及醇提物的增敏机制还有待于进一步研究。同时，白及醇提物中能够增强MRSA对抗生素的敏感性的具体有效成分也尚待确定。

有效药的缺少与病症感染的增多使得抗耐药菌新药的开发成为必然，筛选出中药增敏剂，增强MRSA对苯唑西林的敏感性，提升苯唑西林的抗菌作用则有巨大市场前景。本次实验成功地筛选出了白及醇提物具有增敏作用，这不仅为MRSA的临床诊疗和院内感染控制提供了新的思路，同时也为白及开辟了新的应用领域。