基于网络药理学探讨桃仁-红花药对活血化瘀的分子机制＊

杨凯麟，曾柳庭，葛安琪，葛金文，龙治勇，鲍婷婷，蒋 燕

（1.湖南中医药大学医学院 长沙 410208；2.湖南中医药大学中西医结合学院 长沙 410208；3湖南中医药大学第一附属医院 长沙 410007；4.北京中医药大学 北京 100029；5.南华大学附属第一医院 衡阳 421001）

药对是连接单味中药与方剂的桥梁，兼具方剂的基本主治功效，其以四气五味、升降沉浮、归经、有毒无毒等中药药性理论和相辅相成或相反相成的组合原理为配伍基础[1]。桃仁-红花是活血化瘀的经典药对。桃仁（Persicae Semen）具有活血化瘀，润肠通便，止咳平喘之功效，用于经闭痛经，癥瘕痞块，肺痈肠痈，跌扑损伤，肠燥便秘，咳嗽气喘[2]，而红花（Carthami Flos）能活血通经，散瘀止痛，用于经闭，痛经，恶露不行，癥瘕痞块，胸痹心痛，瘀滞腹痛，胸胁刺痛，跌扑损伤，疮疡肿痛[2]。二药均系活血化瘀之品，前者质重沉降，偏入里走下，破瘀力强；后者质轻升浮，善走外达上，行血力胜。二者相互配对，破瘀而利血行，行血而利瘀去，从而使活血化瘀之力倍增[3]。因此本研究基于网络药理学的方法，对桃仁-红花药对活血化瘀的分子机制进行分析，为传统药对作用机制研究提供新的范式。

1 材料与方法

1.1 目标化合物的选取

本研究中的中草药植物中所含化合物从TCM@Taiwan 数 据 库[4]、Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology（TCMSP）数据库[5]和TCMID数据库 （https：//academic.oup.com/nar/article/41/D1/D1089/1057998）中选取。由于中药发挥药效作用的物质基础是化学成分的组合，中药中虽有众多成分，但只有被吸收入血的成分才能产生作用。因此，基于绝大多数药物在动物体内起作用必须被吸收进入血液这一原理，采用了口服生物利用度（OB）和Caco-2渗透性两个参数来对中草药化合物进行筛选[5-7]。此外，由于中草药成分众多，而且结构具有多样性，因此需要利用类药性（DL）来对成分进行进一步筛选[7]。以上三种参数可在TCMSP数据库中查询，根据该数据库所提供的标准，OB＞30%，Caco-2＞-0.4和DL＞0.18可被认为是符合规定的、可口服吸收的、具有药理活性的化合物，将会成为目标化合物[5-7]。

1.2 已知靶点的搜集

将目标化合物的名称输入SciFinder，选择Categorize选项并选择Genetics＆protein chemistry最后选择其下级菜单Proteins＆peptides获得蛋白质和肽类的已知靶点信息。

1.3 潜在作用靶点反向预测

从SciFinder、TCMSP数据库上获得目标化合物的化学结构的模式图，利用ChemBioDraw 14.0按照模式图进行构建，将其以mol2格式导入PharmMapper进行靶点预测，该数据库采用“反向药效团匹配方法”，以活性小分子为探针通过对Targetbank、Drugbank、Binding DB和PDTD四大数据库[8,9]进行快速检索而获得化合物的靶点信息，并根据匹配结果的相似度进行打分和排序。由于检索到的药物靶点存在命名不规范等问题，本实验用UniProtKB搜索功能，通过输入蛋白名称并限定“物种（Specie）”为“智人（Homo Sapiens）”，将检索得到的所有蛋白校正为其官方名称（Official Symbol），经上述数据库检索和转化操作，获取与活性成分相关的蛋白信息[10]。

1.4 靶点通路注释分析

将靶点导入DAVID数据库以进行信号通路富集，即进行KEGG通路注释。桃仁-红花药对对应的靶蛋白（基因）直接映射到通路上，药物靶点富集的通路被认为是药物调控的通路[10,11]。

1.5 相关网络构建

根据上述桃仁-红花药对的已知靶点搜集、潜在靶点预测以及富集分析的结果，采用网络的可视化软件Cytoscape 3.4.0构建活性成分-预测靶点网络模型和成分-靶点-通路网络模型[12]。网络中的节点（node）表示活性成分、靶点或者作用通路等。节点之间则以边（edge）相连，根据所构建网络的不同，边代表的意义也不同[11,12]。

2 结果

2.1 桃仁-红花药对的成分

通过TCM@Taiwan数据库和TCMSP数据库检索，结合文献[13]，的本次研究共获取了17个成分，其中红花4个，桃仁13个。红花的成分为红花素（醌式红花苷）（Carthamone）、6-羟基山奈酚（6-Hydroxykaempferol）、山奈酚（Kaempferol）、槲皮素（Quercetin）；而桃仁的成分为α1-谷甾醇（Sitosterol α1）、2,3-二脱氢GA70（2,3-didehydro GA70）、GA119、GA120、GA121-isolactone、GA122、GA122-isolactone、赤 霉 素 A44（Gibberellin A44）、赤霉素7（Gibberellin 7）、杨属灵（Populoside）、常春藤苷元（Hederagenin）、β-谷甾醇（β-sitosterol）、菜油甾醇（Campesterol）。

2.2 桃仁-红花药对成分-靶点网络

通过对桃仁-红花药对成分的已知靶点收集并对靶点的主要作用进行分类，主要可分为：改善血流动力学、抗凝血、抗炎、调控细胞凋亡和细胞增殖四个方面发挥活血化瘀的作用。通过以下的对比和分析，单个的细胞因子可能作用介导于多个生物过程，并组成和连同其他多条信号通路作用于一个生物过程，从表1中可以初步看出桃仁-红花的已知靶点可以归纳为四个与活血化瘀作用相关的模块（表1，图1）。

根据分析，发现在改善血流动力学方面，LDL、LDLR、COX1、HDL、AngII、VEGFR2等受到较多成分的作用，这些生物活性物质介导了血管的动脉粥样硬化、血管重构；在凝血-抗凝血作用中，F2、Hemagglutinins受到较多的成分调控；在炎症-抗炎作用中CRP、CYP450、IL1β、IL6、TNFα、ICAM1、IL1、NF-κB受到较多成分的调节，其中IL1、IL6、TNFα、NF-κB是炎症通路中的核心因子；在肿瘤细胞的增殖和死亡作用方面，P53、BCL2、CASP3、BAX、TGFβ等受到较多成分的作用，其中经典的抑癌基因P53和相关抗凋亡因子。每一个单一成分均可调控较多靶点，不同成分所侧重调控的分子靶点群有所不同，例如山奈酚和槲皮素均善于调控改善血流动力学、抗凝血、抗炎和肿瘤细胞的增殖和死亡相关的分子靶点群，而常春藤苷元擅长于调节抗炎和肿瘤细胞的增殖和死亡相关的分子靶点群等。这些侧面反映出了中药多成分-多靶点的特性（图1，表1）。

2.3 桃仁-红花药对成分-靶点网络点图

由于桃仁-红花药对中有些化学成分的现代药理研究较少或已有药理作用的化学成分现代药理研究报道的不深入，有必要利用预测的潜在靶点来进行进一步的网络关联性分析与研究。

图1 桃仁-红花药对的中药-成分-靶点网络

通过PharmMapper的预测，17个成分一共反馈回317个靶点。结合所有数据构建“成分-靶点网络”。该网络由334个节点和2227条边构成。在这一图中，靠近圆心的节点相对靠外的节点受到更多药对成分的作用。这表明，大部分靶点可以通过多种化合物来调节，而非仅仅通过一个来调节。例如CA2、CDK2、PDPK1、GSTP1、BACE1等可由所有17个成分来调节，除了最外围的Nodes，内部的Nodes均可由一个以上的有效成分来调节（图2）。

2.4 桃仁-红花药对通路富集

通过KEGG分析探讨桃仁-红花药化瘀作用预测靶点的通路分布，返回128条信号通路。根据所获取的靶点、信号通路等数据，构建“单味药-潜在靶点-信号通路”网络，将单味药、多个靶点及多条通路间的关联关系（图3，表2）。

表1 桃仁-红花活血化瘀的已知靶点归纳

总之，在这些相关的通路中，涉及了血瘀证中对应的大部分疾病的主要病理机制，如心血管疾病中的代谢紊乱，炎症介质的介导发展，免疫系统的调节以及肿瘤的发生发展机制。

3 讨论

瘀血是传统医学多种疾病共同存在的病因及病理产物，而炎症反应是现代医学多系统疾病研究中的热点环节。两者相互之间在病理、病机及治疗方面存在密切的关系。基础和临床研究的结果显示血瘀与炎症具有很大的相关性，主要集中在血瘀证与炎症、血流动力学、微循环、血小板功能、凝血与抗凝血、纤溶与抗纤溶等方面，结合现代药理的研究显示造成瘀血的病理因素主要集中在三个方面：①体外生物性因素和理化因素所致的病理状态；②体内脏器衰竭引起炎症因子的瀑布性级联反应；③体外因素所致的炎症因子与体内脏器炎症因子的相互促进[14]。血瘀的现代病理研究表明各种致病因子所造成的全身或局部组织器官缺血、缺氧、血瘀、血液循环障碍以及血液流变性和粘滞性异常等一系列的病理变化[15]。因此，根据目前对血瘀的现代病理研究，炎症反应在血瘀证的发生发展中发挥了重要的作用。目前血瘀证的病理基础研究支持血瘀证伴有全血黏度、血浆黏度、红细胞压积升高，血小板聚集性增强，电泳时间延长，体外血栓形成的干湿量及长度增加，纤维蛋白原增高等病理变化[14]。另有部分研究认为，瘀血证除与上述病理异常有关外，还与血管内皮细胞的损伤、动脉粥样硬化、局部缺血缺氧、血栓形成、微循环障，炎症病理过程、免疫功能障碍、结缔组织代谢异常、细胞增殖性病变、内脏病理肿大、内脏及肢体血流量分布异常等病理变化过程有关[16]。近年来，大量实验研究发现以上许多不同疾病过程中都与血瘀证有着密切的关系,而炎症反应从一个侧面揭示了血瘀证的实质，大量血瘀证与炎症相关性研究显示，血瘀证在活性因子、临床治疗及动物模型方面与炎症存在着密不可分的关系，炎症、免疫反应与肿瘤等病理机制在一定程度上介导了血瘀证的发生发展，并且相互作用促进[15,17-19]。此外，在目前大量的临床及实验研究中发现，在肿瘤的发病过程中，与血液循环有关的许多因素的检测指标的异常，如外周循环障碍，血液流变学的改变以及抗凝血机制的减弱等都与肿瘤血瘀证的形成密切相关[20,21]。

图2 桃仁-红花药对成分-靶点网络

表2 信号通路一览表

综上，血瘀证主要与血流动力学异常、凝血异常、炎症反应和细胞恶性增殖性有关。在桃仁-红花药对的中药-成分-靶点网络（图1）中，根据已知靶点的作用特征归纳总结为四个分子靶点群，称为“模块”：改善血流动力学、抗凝血、抗炎、肿瘤细胞的增殖和死亡相关方面，这与传统血瘀证四个特征：血流动力学异常、凝血异常、炎症反应和肿瘤形成相对应。通过网络分析发现在改善血流动力学方面，LDL（6个边）、LDLR（5个边）、COX1（5个边）、HDL（5个边）、AngII（4个边）、VEGFR2（3个边）等受到较多成分的作用；在凝血-抗凝血作用中，F2（6个边）、Hemagglutinins（4个边）受到较多的成分调控；在炎症-抗炎作用中CYP450（10个边）、IL1β（6个边）、IL6（6个边）、TNFα（6个边）、ICAM1（6个边）、IL1（6个边）、CRP（5个边）、NF-κB（5个边）受到较多成分的调节；在肿瘤细胞的增殖和死亡作用方面，BCL2（6个边）、CASP3（6个边）、BAX（5个边）、TGFβ（4个边）等受到较多成分的作用。这些模块中的靶点可能分别是桃仁-红花药对改善血流动力学、凝血-抗凝血、炎症-抗炎、影响肿瘤细胞的增殖和死亡的核心靶点。我们的研究显示山奈酚、槲皮素、菜油甾醇、β-谷甾醇均能改善血流动力学、抗凝血、抗炎和肿瘤，同时常春藤苷元则主要集中于抗炎和肿瘤细胞的增殖和死亡，赤霉素A44主要集中于改善血流动力学.同时，现代实验研究显示，桃仁-红花药对的提取物能通过影响血流动力学、血浆凝血和血小板聚集来促进血液循环[22]；山奈酚能抑制血栓形成和血小板活化[23,24]，槲皮素能抑制凝血酶的活性，抑制纤维蛋白凝块的形成和血液凝固[25,26]，间接验证了桃仁-红花药对活血化瘀是通过其化学成分的改善血流动力学、凝血-抗凝血等作用实现的。而其它成分由于收集到的靶点较少，不足以观察其主要作用。基于现有的桃仁-红花药对多组分药理学研究从侧面也反应了桃仁-红花药对多组分-多靶点干预血瘀证各个信号途径与生物过程的特性。

化学成分-潜在靶点网络的结果分析显示，大部分靶点多通过多组分化合物来调节，而非仅仅通过一个来调节，其中CDK2、MMP3、F2、METAP2、HSP90AA1（热休克蛋白90-α）、ALB（血清白蛋白）、MMP12（巨噬细胞弹性蛋白酶）、F10（凝血因子10）等靶点是频率最高的靶点之一（可被几乎所有化学成分所调控），其中ALB等靶点主要与改善血液流变性有关，F2、F10等靶点与抗凝血有关，MMP3等靶点与抗炎有关，CDK2、METAP2、HSP90AA1、MMP12等靶点与肿瘤形成相关的基因有关。与此同时，各组分化合物中红花素（154个边）、槲皮素（145个边）、山奈酚（143个边）、杨属灵（141个边）成分连接的潜在靶点最多，可能是桃仁-红花药对活血化瘀的主要成分或者核心成分。从化合物分子结构预测其原理作用和活性靶点的角度也反应了该药对多组分-多靶点协同干预血瘀证不同途径以及上下游不同信使和基因靶点的特性。这些预测靶点集合与已知靶点集合有存在重叠之处；例如预测靶点集合和已知靶点集合均含有F2、ANG、IL2等，这些重叠的部分间接体现了预测靶点网络的可靠性。部分出现在已知靶点网络中的靶点未出现在预测靶点网络中（例如CYP450、ATIII、COX2等），这可能是由于有效成分通过预测靶点间接作用于这些未出现在预测网络中的已知靶点。此外，预测靶点存在一些未出现于验证靶点网络中的靶点，这些新的靶点可能是未来实验验证的方向。

从单味药-潜在靶点-信号通路网络的构建来看，我们可以发现桃仁-红花药对构建的通路主要与肿瘤相关通路、代谢相关的通路、免疫相关的通路主要集、内分泌相关的通路、细胞过程相关通路、信号转导相关通路等有关。其中，与内分泌相关通路，如胰岛素信号通路[27]、雌激素信号通路[28-30]、催乳素信号通路[31-33]等通路，间接影响了血流动力学。与信号转导相关的通路则几乎涵盖了大部分的在肿瘤、炎症与免疫方面的通路，如PI3K-Akt信号通路[34-38]、VEGF信号通路[38,39]、MAPK信号通路[40-42]、mTOR信号通路[38]、NF-kappa B信号通路[35]等。

综上所述，槲皮素、山奈酚、菜油甾醇、β-谷甾醇可能是桃仁-红花药对干预血瘀证的主要活性成分，结合预测靶点数据来看，红花素、杨属灵等可能是潜在的活性成分。从靶点的层面看CDK2、MMP3、F2、METAP2、HSP90AA1、ALB、MMP12、F10等一系列由多化学成分调控的靶点可能是其对干预血瘀证中的主要活性靶点。从预测的有效成分靶点来看未来桃仁-红花药对在血瘀证方面的研究主要可以从TNF信号通路、TRP通道的炎症介质调节、FcγR-介导的吞噬作用、NOD样受体信号通路、PI3K-Akt信号通路、VEGF信号通路、MAPK信号通路、HIF-1信号传导途径、cAMP信号通路、AMPK信号通路、mTOR信号通路、NF-kappa B信号通路、cGMP-PKG信号通路等相关信号通路入手，进行新的进一步的探索探索。

中药作为中医药临床实践过程中的最重要一环成为中药发展和走向临床应用的最终瓶颈，尽管其功效已为几千年的历史和现代临床疗效所肯定但其现代化如今已经成为中医药发展的共识，其现代化过程之路从最初的中药系统整理文献，揭示蕴含在文献中的辩证、用药的一般规律，到现在运用定量科学模型的数字化方法和生物生化分子学的发展以及生物计算机学的工具对中药重新进行传统理论的阐述。本文通过对桃仁-红花药对化学成分的获取与筛选，利用数据库收集其已知靶点并用分子反向对接的方法获取其潜在靶点，利用DAVID进行KEGG通路注释分析，最后利用cytoscape 3.4.0软件对已知靶点网络、化学成分-潜在靶点网络和单味药-潜在靶点-信号通路网络进行分析，从而对该药对的化学成分、作用靶点、作用通路三个层次，整体、组织、细胞、分子四个药理水平所获得的多有效成分、多指标数据进一步挖掘与分析桃仁-红花的物质基础和作用机理。

4 结论

通过网络药理学方法，发现了已知靶点所分成的四个模块与血瘀证的四个特性相对应，发现潜在作用靶点及其信号通路的富集所获得的128个信号通路涉及血瘀证的多种病理生理过程，体现了桃仁-红花药对干预血瘀证的分子机制。这体现了桃仁-红花药在“药物-疾病-细胞-分子”方面对血瘀证的影响，不仅为桃仁-红花药对的活血化瘀作用提供了理论依据及为未来的相关研究提供了基础，同时对桃仁-红花药对等传统药对作用机制研究提供新的范式。