EI注射液对鹅膏蕈氨酸基底核微量注射痴呆模型大鼠ATP/AMP及PI3K/AKT信号通路的影响＊

夏 鹏，郑 航，秦莉霞，魏江平，高丽娟，申重阳，徐世军＊＊

（1.成都中医药大学药学院 成都 611137；2.成都中医药大学中医脑病药物整合转化研究所成都 611137；3.成都中医药大学基础医学院 成都 611137）

阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease，AD）是老年痴呆的主要类型，其发病机制复杂、病理进程多变，面临着治疗和诊断的双重挑战。大量研究显示AD发病过程中伴随着明显的葡萄糖利用率降低和胰岛素抵抗，故本病有3型糖尿病之称[1,2]。胰岛素信号级联参与AD病程多种病理过程[3]，磷脂酰基醇3激酶/蛋白激酶B（Phosphatidyl alcohol kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）信号通路作为胰岛素代谢的关键信号通路，参与调节葡萄糖摄取[4]。大脑是人体的高耗能器官[5,6]，基于其对能量的高需求及高敏感性，使得大脑很易受到缺血等外部损伤的危害[7]。葡萄糖是大脑重要的能量物质，主要通过三羧酸循环（Tricarboxylic Aic Cycle，TCA）等氧化分解代谢过程释放三磷酸腺苷（Adenosine Triphosphate，ATP），为维持神经细胞、神经胶质细胞功能及脑稳态提供能量[6,8]。研究表明AD病理进程中伴随着明显的能量代谢障碍[9,10]。二磷酸腺苷（Adenosine Diphosphate，ADP）和 一 磷 酸 腺 苷（Adenosine Monophosphate，AMP）是ATP的代谢产物。ATP含量[11]、ADP/ATP 比值[12]、ATP/AMP[13]比值与葡萄糖代谢、AD病程密切相关[14]。EI注射液是一温里药活性成分制备而成的注射剂，前期预实验显示有一定的抗AD作用，但其对AD模型大鼠脑能量代谢的影响还未涉及。

1 材料

1.1 药物与试剂

EI注射液活性成分，成都瑞特恩科技有限公司，批号：RL20140828；鹅膏蕈氨酸（IBO），Cayman，批号：14584；安理申，卫材（中国）药业有限公司，批号：1511049；三磷酸腺苷二钠（ATP），Sigma，批号：1001665433；二磷酸腺苷二钠（ADP），Sigma，批号：1001726877；单磷酸腺苷二钠（AMP），Sigma，批号：101606467；Rat Insulin 试剂盒，ExCell Bio，批号：21G286；PI3K 一抗，Cell Signaling Technology，批号：4257S；AKT一抗，Cell Signaling Technology批号：4685S；p-PI3K一抗，Cell Signaling Technology批号：4228S；p-AKT一抗，批号：4060S。

1.2 动物

SPF级，SD大鼠65只，雄性，体质量240-300 g，由成都达硕生物科技有限公司提供，许可证号：SCXK（川）2015-030，合格证号：51203500001591。

1.3 仪器

DW-5大鼠脑立体定位仪（成都泰盟）；Etho Vision Morris水迷宫分析系统（荷兰，Noldus）；ODSHYPERSIL C18色谱柱（thermo）；1260高效液相色谱仪（Agilent）；3001酶标仪（thermo electron corporation）；Champchemi 610Plus全自动多色荧光及化学发光凝胶成像系统（北京赛智创业科技有限公司）。

2 方法

2.1 动物造模与分组

根据文献制备双侧基底核注射IBO拟痴呆模型[15]。假手术组除基底核注射无菌生理盐水外，其他操作同造模。取造模大鼠32只，随机分为模型组、安理申组（1.4 mg·kg-1）、EI高剂量组（2 mg·kg-1）、EI低剂量组（1 mg·kg-1），每组8只，取假手术大鼠8只为对照组。各组动物尾静脉注射等体积相应药物（2 mL·kg-1），假手术组和模型组动物给予等体积生理盐水（2 mL·kg-1）。每天一次，连续8周。

2.2 学习记忆功能测定

给药50天开始，进行Morris水迷宫检测[16]，期间继续给药。连续训练5天，记录各组动物逃避潜伏期，定向航行实验结束24 h后撤去平台，进行空间探索实验，记录各动物穿越平台目标象限的时间、穿越平台目标象限的次数、穿越平台次数及穿越平台区域次数。

2.3 海马及大脑皮层刚果红染色检测

Morris水迷宫检测后，处死大鼠。分离脑组织，10%多聚甲醛固定、脱水、包埋、5µm切片、染色，镜下观察海马及皮层的神经细胞形态及Aβ沉积。

2.4 大鼠脑能量检测

冰上分离脑组织，制样、检测脑组织ATP、ADP、AMP含量[17]。

2.5 脑组织胰岛素含量的测定

胰岛素检测严格按照ELISA试剂盒说明书进行。

2.6 大鼠脑组织PI3K和AKT蛋白表达

取脑组织，制样、凝胶电泳分离、转膜、封闭、一抗4℃孵育过夜，TBST洗膜，二抗室温孵育90 min，TBST洗膜。ECL化学发光显色后分析各蛋白相对表达量。

2.7 统计学方法

数据以均数±标准差（xˉ±s）表示，Morris水迷宫逃避潜伏期用双因素方差分析，其余符合正太分布数据采用单因素方差分析（one-way ANOVA），不符合正态分布的数据采用两个独立样本t检验进行分析。

3 结果

3.1 EI注射液对IBO拟痴呆模型大鼠学习记忆功能的影响

随着训练天数的增加，各组动物逃避潜伏期均有不同程度的缩短（图1）。与空白组相比，模型组动物逃避潜伏期明显延长（F=32.92；P=0.0012），穿越平台象限时间明显缩短（P＜0.05）、穿越平台次数、穿越平台区域次数明显缩短（P＜0.05）；与模型组相比，EI注射液高剂量组逃避潜伏期明显缩短（F=9.812；P=0.0203），EI注射液低剂量组逃避潜伏期明显缩短（F=20.61；P=0.0039），穿越平台象限时间显著延长（P＜0.05），穿越平台次数和穿越平台区域次数有增加趋势但无统计学差异（P＞0.05）。

3.2 EI注射液对IBO拟痴呆模型大鼠海马组织病理学及Aβ斑块沉积的影响

模型组动物海马CA1区及皮质区均可见砖红色染色深，β淀粉样蛋白沉积分布广泛，锥体细胞排列紊乱稀疏、细胞数量减少并伴随细胞固缩；与模型组相比，EI注射液各剂量组海马CA1区和皮质区砖红色染色减轻，β淀粉样蛋白沉积减少，锥体细胞排列整齐、细胞数量增加（图2，图3）。

图1 EI注射液对IBO模型大鼠Morris水迷宫的影响

3.3 EI注射液对IBO拟痴呆模型大鼠脑ADP/ATP和ATP/AMP的影响

由图4可知，与空白组比较，模型组动物脑组织ATP/AMP明显降低（P＜0.05）；ADP/ATP无明显趋势；与模型组相比，EI注射液各剂量组ATP/AMP明显升高（P＜0.05），ADP/ATP无明显趋势。

3.4 EI注射液对IBO拟痴呆模型大鼠脑胰岛素含量的影响

与空白组比较，模型组脑组织内胰岛素含量明显降低（P＜0.05）；与模型组相比，EI注射液各剂量组胰岛素含量明显增高（P＜0.05）（图5）。

3.5 EI注射液对IBO拟痴呆模型大鼠脑PI3K、AKT的影响

由图5可知，与空白组比较，模型组脑PI3K和AKT蛋白呈低表达（P＞ 0.05）；与模型组相比，EI注射液干预组脑组织内PI3K和AKT蛋白表达有激活趋势（P＞0.05）。

4 讨论

图2 EI注射液对IBO模型大鼠海马CA1区病理形态学的影响

图4 EI注射液对IBO模型大鼠脑ADP/ATP、ATP/AMP的影响

AD是主要的老年痴呆病症，其发病机制除Aβ级联假说、Tau蛋白假说、氧化应激等外，能量代谢障碍也扮演着重要角色。EI注射液是从某温中中药中提取的活性成分制备而成的注射剂。部分温热性中药及其活性成分被报道可显著改善多种疾病模型动物能量代谢障碍[18-21]。IBO是一种强烈的神经毒素，脑内注射可对大鼠造成严重的认知功能障碍等一系列拟AD病变[22]，从而被应用于AD造模，本实验结果也显示该模型大鼠出现明显的记忆障碍，而经EI注射液干预后其认知记忆障碍得到明显改善。ATP是大脑的主要能量来源，主要由葡萄糖经TCA代谢提供[23]。胰岛素是葡萄糖代谢的重要把控因子，研究发现AD病程中出现明显的葡萄糖利用率降低和胰岛素抵抗[24]。本实验显示IBO模型大鼠脑内胰岛素含量、ATP/AMP比值显著降低，提示能量代谢不足，经EI注射液干预后，该模型大鼠脑内胰岛素、ATP/AMP比值显著上调，提示EI注射液可调节该模型大鼠脑内能量代谢。PI3K/AKT信号通路是调节胰岛素代谢的重要信号因子[4]，同时研究显示该信号通路参与调节认知功能障碍和突触功能障碍等AD相关病程[25]。本实验结果显示IBO模型大鼠脑内PI3K/AKT蛋白表达呈抑制趋势，但未见显著统计学差异，提示EI注射液调节AD模型大鼠脑能量代谢可能与胰岛素代谢其他机制相关，。综上，本实验结果显示，EI注射液可改善IBO模型大鼠认知功能障碍，其可能机制与调节该模型大鼠脑内胰岛素能量代谢有关，但其如何调节该AD模型大鼠脑能量代谢还有待后续进一步研究。

图5 EI注射液对IBO模型大鼠脑胰岛素含量的影响

图6 EI注射液对IBO模型大鼠脑PI3K/AKT信号通路的影响