辅酶Q10辅助辛伐他汀治疗激素相关性兔股骨头坏死的疗效和可能机制

丁文波 杨 璐 宫兆奇 李明欣

(丹东市中心医院骨外一科，辽宁 丹东 118000)

糖皮质激素(以下简称“激素”)的过度使用，所造成的副作用是极其严重的。临床上将该类由激素引起的股骨头坏死统称为激素性股骨头坏死(SANFH)〔1〕。目前，SANFH机制尚无统一的结论，研究发现，使用激素处理成骨细胞及骨细胞可促进其凋亡，从而导致骨细胞数量减少，最终引起股骨头坏死〔2〕。激素可能通过结合成骨细胞、破骨细胞及骨细胞的表面受体，从而调控细胞核内某些基因转录和翻译〔3〕。持续使用激素数周可显著促进小鼠体内成骨细胞凋亡，同时也可引起大量的皮质骨干骺端的骨细胞凋亡，该凋亡过程可能是由于激素诱导了凋亡相关基因的表达〔4〕。他汀类药物除降脂功能外，其抗感染作用，清除自由基，抗氧化作用，促血管生成及修复血管内皮功能等功效也被广泛报道〔5〕。他汀类药物可以通过提高骨细胞中骨形态发生蛋白(BMP)2的表达以促进成骨作用，并降低破骨细胞的活性〔6，7〕；还可以通过抑制激素诱导的骨髓基质干细胞的成脂化，最终促进成骨分化〔8〕。辅酶Q10又称作癸烯醌、泛醌和维生素Q10，可以参与线粒体氧化磷酸化和ATP的产生，调控细胞氧化还原的环境；也可以在电子穿膜过程中携带还原电子进入囊泡内或带出到胞外，并参与内膜和质膜之间的质子梯度的形成〔9，10〕。此外，在病变组织中加入外源性辅酶Q10，可有效缓解组织中辅酶Q10 缺乏的状态，并且可以维持细胞膜上离子通道的完整，进而使细胞膜结构保持稳定；同时辅酶Q10的脂溶特性还可以使其通过血脑屏障，抑制脂质造成的细胞过氧化损伤，进而减少细胞凋亡〔11，12〕。本文拟分析辅酶Q10发挥辅助辛伐他汀治疗兔SANFH的作用及可能机制。

1 资料与方法

1.1试剂及药物 辅酶 Q10(30 mg/片，能气朗)购自卫才药业有限公司，地塞米松磷酸钠注射液购自焦作福瑞堂制药有限公司，乙二胺四乙酸(EDTA)-Tris 缓冲液(100 g/L)购自上海士锋生物科技有限公司，辛伐他汀分散片(辛可)购自广州市南新制药有限公司，0.9%氯化钠注射液(250 ml)购自四川科伦药业股份有限公司，10%中性甲醛溶液(0.1 mol/L，pH7.4)购自上海哈灵生物科技有限公司。

1.2构建兔SANFH模型 将健康成年新西兰大白兔随机分成空白对照组15 只和实验组60只。向实验组兔双侧臀大肌以20 mg/kg剂量左右交替注射地塞米松磷酸钠，1次/w，持续6 w制备兔SANFH模型。6 w后将造模成功的45只兔随机分成模型组、辛伐他汀组和辛伐他汀联合辅酶Q10组各15只。分组方案及给药情况如下：对照组左右交替通向大白兔双侧臀大肌注射0.9%氯化钠注射液；注射6 w后用蒸馏水灌胃。造模成功后，模型组蒸馏水灌胃。辛伐他汀组以辛伐他汀10 mg·kg-1·d-1灌胃治疗。辛伐他汀联合辅酶Q10组以辛伐他汀 10 mg·kg-1·d-1和辅酶 Q10 30 mg/kg灌胃给药。灌胃8 w后进行一系列实验。

1.3一般情况观察及骨细胞凋亡检测 观察记录各组兔体重、精神状况、饮食状况及毛发变化(如光泽度)，为了避免兔子双腿的负重，应适当降低饲养笼中饮水及饲料的高度，以有利于股骨头坏死的治疗。处死兔后，术区消毒、剪毛，逐层分离暴露髋关节嚢，切开关节嚢后取下股骨头。之后对去除的股骨头进行解剖，对股骨头形态，光泽及软骨颜色进行观察。骨细胞凋亡的检测采用原位末端标记法(TUNEL)。将组织切片染色后，当胞核出现黄色颗粒，即凋亡细胞，图中以绿色荧光表示。

1.4实验兔血清乳酸(LA)含量的测定 使用商业化试剂盒(购自武汉艾美捷科技有限公司)，严格按照厂商说明书中的步骤进行测定。

1.5实验兔血清超氧化物歧化酶(SOD )活性的测定 使用商业化试剂盒(购自武汉艾美捷科技有限公司)，严格按照厂商说明书中的步骤进行测定。

1.6实时定量PCR测定BMP2的基因表达 组织剪碎至EP管，Trizol试剂法提取总RNA。最后用75%乙醇洗涤总RNA两次，自然晾干，用焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶解。紫外分光光度计测定A260/A280的比值，在1.8～2.1范围内视为总RNA纯度较高，可以使用。反转录用 TaKaRa PrimeScript 试剂盒的 SYBR GreenAssay根据厂家说明书进行。反应体系如下：2 μl 5×PrimeScript缓冲液，Prime Script RT Enzyme，Oligo dT Primer和Random 6mers 各0.5 μl，总 RNA 定量到500 ng，加入不含RNase的双蒸水，得到的终体系为10 μl。然后用得到的cDNA为模板采用 7300 Real-time PCR 系统进行实时定量PCR检测。反应体系为：2 μl cDNA模板，上游引物和下游引物各0.5 μl，5 μl 2×混合缓冲液和2 μl双蒸水。以2-ΔΔCt值进行结果分析其中ΔCt=Ct 基因-Ct内参。

1.7Western印迹法测定BMP2蛋白及天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3的表达 向各组样品中分别加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制剂，提取总蛋白后，使用BCA蛋白定量试剂盒(购自上海碧云天生物科技有限公司)进行蛋白浓度的测定，之后每个样品中加入上样缓冲液，沸水浴10 min使蛋白变性，然后进行下游实验或放置-20℃储存备用。将上述所得样品用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离，然后将样品转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。随后将膜放入含有5%脱脂奶粉的Tween-20 Tris-磷酸盐缓冲液(PBST)中，置于摇床室温封闭2 h；之后用PBST洗膜3次，每次10 min。加一抗4℃摇床过夜(一抗溶于封闭液，1∶300稀释)；第二天，Tween-20 Tris盐酸缓冲液(TBST)洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h候，加入电化学发光(ECL)显色液(购自上海碧云天生物科技有限公司)进行显色。

1.8统计学方法 采用SPSS20.0统计软件进行t检验。

2 结 果

2.1一般情况及骨细胞凋亡检测结果 对照组兔无异常表现，体重逐渐增加，反应较为灵敏，精神状态好，饮食一切正常，毛发光泽度好。模型组兔明显处于病态，反应较迟钝，精神状态萎靡不振，不喜欢行动，毛发光泽度差。辛伐他汀组兔实验初期与模型组状况类似，灌胃4 w后，活动量和体重均增加，精神状态恢复，反应较灵敏，走路姿势呈好转趋势，毛发光泽度好，脱落较少。辛伐他汀联合辅酶Q10组情况较辛伐他汀组更好，治疗效果更明显。对照组兔股骨头外形始终光滑完整，颜色正常；模型组兔股骨头总体形态完整，但表面不光滑，色泽较暗，呈灰白色；辛伐他汀组兔股骨头表面完整，基本光滑，颜色接近正常；辛伐他汀联合辅酶Q10组较辛伐他汀组更好。对照组无显著骨细胞凋亡，模型组细胞凋亡较多，辛伐他汀联合辅酶Q10组及辛伐他汀组均有不同程度凋亡，但较模型组均有显著改善；辛伐他汀联合辅酶Q10组较辛伐他汀组更好，见图1。

2.2SOD活性 和对照组相比，灌胃8 w后模型组SOD活性明显降低，辛伐他汀组和辛伐他汀联合辅酶Q10组较模型组SOD活性显著增高，辛伐他汀联合辅酶Q10组效果比辛伐他汀组显著(P<0.05)，见表1。

2.3LA含量 和对照组相比，灌胃8 w后模型组LA明显升高，辛伐他汀组和辛伐他汀联合辅酶Q10组较模型组LA含量显著降低，辛伐他汀联合辅酶Q10组比辛伐他汀组更显著(P<0.05)，见表2。

图1 各组骨细胞凋亡检测(×400)

表1 各组各时段SOD活性

与对照组相比：1)P<0.05；与模型组相比：2)P<0.05；与辛伐他汀组相比：3)P<0.05；表2同

表2 各组各时段LA含量

2.4BMP2 mRNA和蛋白水平 和对照组(1.0±0.1、1.5±0.4)相比，模型组BMP2 mRNA水平(0.4±0.1)和蛋白水平(0.9±0.2)明显降低，辛伐他汀组(1.0±0.2、1.1±0.2)和辛伐他汀联合辅酶Q10组BMP2 mRNA(0.8±0.1)和蛋白水平(1.3±0.2)显著增加，辛伐他汀联合辅酶Q10组效果比辛伐他汀组显著(P<0.05)，见图2。

2.5Caspase-3蛋白水平 和对照组(0.2±0.1)相比，模型组Caspase-3蛋白水平(0.8±0.2)明显升高；辛伐他汀组(0.4±0.1)和辛伐他汀联合辅酶Q10组Caspase-3蛋白水平(0.6±0.2)较模型组显著降低，辛伐他汀联合辅酶Q10组效果比辛伐他汀组显著(P<0.05)。见图2。

图2 各组BMP2与Caspase-3蛋白水平

3 讨 论

股骨头坏死是在一种骨科常见的对髋关节具有特殊破坏性的病变，一般来说，其病程较长，再加上其发病机制尚不明确，导致治疗效果差，患者的致残率很高。目前手术的方法很多，如带血管蒂的排骨移植〔13〕、髓芯减压〔13〕、血管束植入和表面置换〔14，15〕等，均可以取得一定疗效，但都不可以彻底治疗。

SANFH是股骨头坏死的一个常见类型，该病往往以局部股骨头的骨髓坏死及骨小梁破坏作为其基本临床特征〔1〕，而这种现象的原因主要是由于滥用激素引起的股骨头局部区域的供血障碍。目前，对于其发病机制的认识主要有以下几种可能：细胞凋亡学说：有学者认为激素可以通过促进成骨细胞和骨细胞凋亡，引起骨细胞数量减少进而导致股骨头坏死。而细胞凋亡信号的激活进一步引起细胞内各种信号通路的激活，最终导致细胞的各种生物学行为的紊乱，从引起继发性组织损伤〔4〕；间充质干细胞(MSC)脂肪分化学说：MSC是一种最常见的干细胞，其具有包括成骨、成脂肪、成软骨等多向分化潜能，Yin 等〔16〕从分子生物学角度证实了，激素可以诱导MSC向脂肪定向分化，而这样的结果可能导致患者骨内压增加进而引起股骨头坏死；而Wang等〔17〕的结果也证实导致股骨头坏死的重要原因是激素诱导的MSC成脂分化。外源性辅酶Q10 能减少由于细胞脂质过氧化损伤引起的细胞凋亡〔11，12〕。本研究表明，辅酶Q10可以辅助辛伐他汀缓解兔股骨头坏死，但相应机制还不清楚。本文结果和关于辅酶Q10功能的报道一致〔9，10〕。研究发现，他汀类药在体外及大鼠和小鼠体内都可促进新骨生成并伴有BMP2表达的增加〔7〕。本文结果和关于辅酶Q10抑制凋亡的报道一致〔11，12〕。

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