p38 MAPK在阿尔茨海默病患者中的表达及作用机制

任啟霞 崔 琼 解承娟

(青海省第三人民医院检验科，青海 西宁 810001)

阿尔茨海默病(AD)临床主要表现为记忆力下降，言语、认知等功能受到损害〔1〕。目前AD的发生机制尚未明确，神经元丢失、老年斑产生及神经纤维的聚集可能是其发生的重要原因〔2〕。丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)是一种广泛表达于哺乳动物的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，能够通过三级级联反应将外界信号传递到细胞核，调控靶基因转录，参与细胞生长、发育、分化、凋亡等过程〔3～5〕。p38 MAPK在外界刺激如渗透压变化、紫外线、生理应激、缺氧、高糖、高脂等刺激下会促进细胞凋亡，被称为应激MAPK信号通路〔6〕。已有研究表明，p38 MAPK在AD脑组织中被激活〔7〕，但在外周血中的表达尚未见报道，且p38 MAPK在AD的发生发展中的作用报道较少，本研究将进一步探讨p38 MAPK在AD患者外周血淋巴细胞中的表达及相关机制。

1 材料与方法

1.1标本来源 根据美国国立神经病语言障碍脑卒中和阿尔茨海默病及相关疾病学会(NINCDS-ADRDA)AD的诊断标准，收集2015年3月至2017年3月青海省第三人民医院进行诊断的82例AD患者，其中男32例，女50例，年龄67～82〔平均(68.9±1.56)〕岁，病程1.2～4.3年。患者均无自身免疫性疾病或内分泌性疾病，也无因脑血管、脑外伤等导致的血管痴呆，家族无精神病史。同时期在本院进行健康体检的志愿者20例，男6例，女14例，年龄68～82〔平均(70.1±2.32)岁〕。患者或家属知情同意，并由我院伦理委员会通过。

1.2试剂与仪器 四甲基偶氮唑盐(MTT)、DMEM培养基均购自美国Hyclone公司；p38 MAPK抑制剂SB203580、二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒、Annexin V-FITC/PI流式双染试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；兔抗人p38 MAPK，pp38 MAPK，B淋巴细胞瘤，Bcl-2，Bcl-2相关X蛋白(Bax)，p53，酶切天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)3及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)多克隆抗体均购自美国Abcam公司；Caspase3活性检测试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司。MK3酶标仪购自美国thermo公司；FACSCalibur流式细胞仪购自美国BD公司；DYCZ-25D型双垂直电泳仪，DYCZ-25D型转印电泳仪均购自北京六一生物科技有限公司；ChemiDocTM XRS凝胶成像系统购自美国伯乐公司。

1.3淋巴细胞的获得 研究对象均于空腹前抽取10 ml静脉血于抗凝管中，室温静置2 h后，加入等量的磷酸盐缓冲液(PBS)混匀，后以1∶2的比例缓慢将混合液加入淋巴细胞分离液中，1 500 r/min离心15 min，此时发现细胞分层，由上至下第2层即为淋巴细胞层，小心取此层细胞液，反复清洗离心2次，即可获得外周血淋巴细胞，然后采用Western印迹检测外周血中p38 MAPK的表达。

1.4分组 大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤PC12细胞购自中国科学院上海细胞库。PC12细胞随机分为正常组、模型组和SB203580组，模型组及SB203580组采用20 μmol/L β淀粉样蛋白(Aβ25～35)构建PC12细胞损伤模型。

1.5MTT法检测细胞活力 将5×103个PC12细胞接种于96孔板，培养24 h，按1.4分组给药，继续培养48 h后，加入20 μl终浓度为5 mg/ml 的MTT孵育4 h，翻转96孔板舍弃上清液，再加入150 μl的二甲基亚砜，震荡使结晶物溶解，于酶标仪波长560 nm处测OD值，即代表细胞活力。

1.6Annexin V-FITC/PI法检测细胞凋亡情况 将8×103个PC12细胞接种于6孔板，培养24 h，按1.4分组给药，继续培养48 h后，每组收集1×105/ml个细胞，加入500 μl结合缓冲液吹打混匀后，再按顺序将5 μl Annexin V-FITC及5 μl PI加入，继续吹打混匀，在室温条件下避光孵育10 min，于1 h内在流式细胞仪上进行细胞凋亡分析。

1.7紫外分光光度法检测Caspase3活性 将8×103个PC12细胞接种于6孔板，培养24 h，按1.4分组给药，继续培养48 h后，收集细胞，加入0.25%胰蛋白酶裂解细胞，收集细胞上清液，按照Caspase3活性检测试剂盒检测Caspase3活性。

1.8Western印迹检测p38 MAPK、pp38 MAPK、Bax、Bcl-2、p53、酶切Caspase3蛋白表达 在冰浴条件下收集细胞，加入细胞裂解液裂解30 min，在4℃条件下离心，收获上清液即总蛋白。采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。制作5%浓缩胶，12%分离胶，室温水封静置30 min。蛋白变性，上样，进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳1～2 h，湿法转膜30～50 min。5%脱脂奶粉封闭1 h，一抗溶液(兔抗人p38 MAPK、pp38 MAPK、Bax、Bcl-2、p53、酶切Caspase3及GAPDH多克隆抗体，稀释度为1∶100)孵育，4℃过夜；二抗溶液室温孵育1 h。在凝胶成像系统中曝光。用Quantity one软件分析各抗体条带灰度值。

1.9统计学方法 应用SPSS17.0软件进行t检验。

2 结 果

2.1p38 MAPK在AD患者外周血淋巴细胞中的表达及激活情况 AD患者外周血淋巴细胞中p38 MAPK表达量(1.04±0.12)与健康志愿者(0.98±0.11)差异无统计学意义(P>0.05)，而AD患者外周血淋巴细胞中pp38 MAPK表达量(1.12±0.12)显著高于健康志愿者(0.34±0.03，P<0.01)。见图1。

2.2SB203580对Aβ25～35诱导PC12细胞活力的影响 与正常组(0.68±0.07)比较，模型组细胞活力(0.38±0.04)降低，与模型组比较，SB203580组(0.59±0.06)显著提高(均P<0.01)。见图2。

2.3SB203580对Aβ25～35诱导PC12细胞凋亡的影响 与正常组(3.18%±0.31%、2.56%±0.25%)比较，模型组细胞早期凋亡率(21.49%±2.15%)及晚期凋亡率(18.32%±1.83%)均显著提高，与模型组比较，SB203580组(7.55%±0.75%、3.24%±0.32%)均显著降低(P<0.01)。

2.4SB203580对Aβ25～35诱导PC12细胞中Bcl-2及Bax表达的影响 与正常组Bcl-2(0.42±0.04)、Bax(0.20±0.02)比较，模型组中Bcl-2表达(0.15±0.10)下调，Bax表达(0.48±0.05)上调(均P<0.01)，与模型组比较，SB203580组中Bcl-2表达(0.32±0.03)上调，Bax表达(0.26±0.03)下调(均P<0.01)。见图2。

2.5SB203580对Aβ25～35诱导PC12细胞中p53及酶切Caspase3表达的影响 与正常组p53(0.13±0.01)、酶切Caspase3(0.16±0.01)比较，模型组中p53(0.42±0.04)及酶切Caspase3(2.19±0.22)表达上调(P<0.01)，与模型组比较，SB203580组(0.17±0.02,0.18±0.02)均表达下调(P<0.01)。见图3。

2.6SB203580对Aβ25～35诱导PC12细胞中Caspase3活性的影响 与正常组Caspase3活性〔(0.56±0.05)μg/ml〕比较，模型组〔(4.38±0.43)μg/ml〕显著提高，与模型组比较，SB203580组〔(1.12±0.11)μg/ml〕显著降低(均P<0.01)。

图2 SB203580对Aβ25～35诱导PC12细胞中Bcl-2及Bax表达的影响

图3 SB203580对Aβ25～35诱导PC12细胞中p53及酶切Caspase3表达的影响

3 讨 论

本研究提示p38 MAPK对AD的发生发展可能起着促进作用。神经元及突触的丢失、神经纤维的聚集及老年斑的产生是AD的主要病理特征〔2〕。Aβ沉积是老年斑形成的主要原因，是AD发生及发展的重要因素〔2〕。Aβ包括Aβ1～40、Aβ1～42、Aβ25～35 3个片段，其中Aβ25～35不仅能够促进老年斑形成，还对神经元具有毒性作用，是模拟AD模型的主要片段之一，是目前AD治疗的主要靶点之一〔8〕。另外SB203580是p38 MAPK特异性抑制剂，是探讨p38 MAPK信号通路阻断后细胞后续应答反应的常用抑制剂〔6〕。因此本研究参考相关文献并预实验〔8〕，结果提示阻断p38 MAPK信号通路能够抑制Aβ25～35诱导的PC12细胞凋亡。

Bcl-2是研究最为广泛的抑制凋亡蛋白，能够与促凋亡蛋白Bax形成异二聚体，阻断凋亡信号的传递，而且还能够抑制p53介导的细胞凋亡，从而促进细胞存活及生长。Bax能够自身形成二聚体，将凋亡信号传递给Caspase家族，促使级联放大，诱导细胞凋亡。Caspase3是Caspase家族下游蛋白，正常生理条件下，以无活性蛋白形式存在，在凋亡因素的刺激下，Caspase3被激活并被切割成酶切Caspase3，导致DNA断裂，细胞形态发生变化，最终诱导细胞凋亡。同时有研究报道通过下调pp38 MAPK表达，进而上调Bcl-2表达，抑制酶切Caspase3表达，能够显著的治疗胆固醇诱导的大鼠动脉粥样硬化〔9〕。降低p38 MAPK磷酸化水平，进而提高Bcl-2表达及Bcl-2/Bax比例，能够显著抑制放射诱导的H9c2心肌细胞损伤〔10〕。本研究结果表明SB203580能显著上调Bcl-2表达，下调Bax、p53及酶切Caspase3表达，降低Caspase3活性，最终抑制Aβ25～35诱导的PC12细胞凋亡。

1郭 敏，李树民，张 弘，等.阿尔兹海默病的表观遗传学机制研究进展〔J〕.中国临床药理学杂志，2014；30(3)：232-4.

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3Reig I，Boixeda P，Fleta B，etal.Neurofibromatosis-noonan syndrome：case report and clinicopathogenic review of the Neurofibromatosis-Noonan syndrome and RAS-MAPK pathway〔J〕.Dermatol Online J，2011；17(4)：4.

4张美荣，刘 举，王 洋.丝裂原激活蛋白激酶相关疾病及其药物的研究进展〔J〕.中国药物化学杂志，2014；24(3)：231-40.

5刘婷婷，张淑萍，覃筱燕，等.MAPK信号转导通路与神经损伤研究进展〔J〕.中国公共卫生，2016；32(2)：248-54.

6肖 云，方 浩.小分子p38 MAPK抑制剂的研究进展〔J〕.中国药物化学杂志，2015；25(4)：306-12.

7Sun A，Liu M，Nguyen XV，etal.P38 MAP kinase is activated at early stages in Alzheimer′s disease brain〔J〕.Exp Neurol，2003；183(2)：394-405.

8申茉函，王全才，杨 丽.β淀粉样蛋白1～42促进神经细胞凋亡〔J〕.中国老年学杂志，2015；35(13)：3498-501.

9Bayatmakoo R，Rashtchizadeh N，Yaghmaei P，etal.Atorvastatin inhibits cholesterol-induced caspase-3 cleavage through down-regulation of p38 and up-regulation of Bcl-2 in the rat carotid artery〔J〕.Cardiovasc J Afr，2017；28：1-6.

10Zhang W，Li Y，Li R，etal.Sodium tanshinone IIA sulfonate prevents radiation-induced toxicity in H9c2 cardiomyocytes〔J〕.Evid Based Complement Alternat Med，2017；2017：4537974.