三氧可通过减轻小鼠脑小胶质细胞激活预防抑郁症发生

芦国芳，安建雄，马 钧，钱晓焱，王 永，杨小荣

抑郁症是危害人类健康和情感性行为的主要疾病之一。据Mathers和Loncar[1]预计，到2030年抑郁症在全球疾病致残率和经济负担的排名中将位居第二。Phillips等[2]2009年在英国TheLancet杂志上发表文章，称中国抑郁症的患病率为6.1%，按其比率推算，国内抑郁症患者已达到9 000万。由于抑郁症发病机制尚不清楚,至今尚缺乏防治抑郁症的理想方法。然而，已有大量研究表明大脑内小胶质细胞激活引起的神经炎症在抑郁症中扮有重要角色，此外，大量研究证实三氧可有效抑制机体炎症反应[3]，已有研究表明小胶质细胞激活引起的炎症反应是抑郁症发生与发展的重要原因[4-6]。然而迄今尚无三氧防治抑郁症的报道。本研究通过建立抑郁症小鼠模型，检测各组小鼠小胶质细胞数量与炎症因子白介素(interleukin,IL)-1β，IL-6和肿瘤坏死因子(tumer necrosis factor- α,TNF-α)的表达水平，探究三氧对抑郁症小鼠的防治作用及机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 C57BL/6J小鼠40只，清洁级，雄性，体重20～30 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司,许可证编号：SCXK(京)2016-0011；医用三氧水由三氧气体溶于500 mL的医用灭菌水配制而成的，溶液为80 μg/mL由医用三氧治疗仪(德国，Ozomed Basic)完成；特制的50 mL离心管；旷场实验系统(美国，Panlab，Harvard Apparatus)；免疫组化IBA1一抗(日本Wako公司)；逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)试剂盒(康为世纪生物技术有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 动物模型制备 将40只小鼠随机分为4组，即模型组、模型加三氧组、对照组和对照加三氧组(预防性干预及治疗性干预小鼠数量和分组方法一致)，对模型组和模型加三氧组小鼠进行连续7 d每天1 h的束缚应激(为保证模型成功，每天束缚小鼠时间需一致)制备抑郁症小鼠模型[7]。

1.2.1.1 三氧预防性干预 造模前3 d对模型加三氧组和对照加三氧组进行腹腔注射三氧水(80 μg/mL，0.1 mL/10 g)干预，模型组和对照组腹腔注射0.9%生理盐水设为对照，1/2d，共5次。

1.2.1.2 三氧治疗性干预 造模成功后，对模型加三氧组和对照加三氧组进行腹腔注射三氧水(80 μg/mL，0.1 mL/10 g)干预，模型组和对照组腹腔注射0.9%生理盐水设为对照，1/2d，共5次。

1.2.2 行为学测试 自三氧干预结束起进行悬尾实验(tail suspension test,TST)、强迫游泳实验(forced swimming test,FST)、新环境抑制进食实验(novelty suppressed feeding test，NSFT)和开放旷场实验(open field test,OFT)行为学测试,实验顺序随机，为期5 d。

1.2.2.1 TST 实验前60 min，将小鼠移至安静的测试房，以缓解动物紧张情绪。实验时将小鼠尾巴用胶带固定起来悬挂在实验架(高于地面50 cm)上，实验持续6 min，前2 min统计小鼠不动前的潜伏期时间，后4 min统计小鼠不动总时间，全程通过高清数码摄像机记录实验过程[8]。

1.2.2.2 FST 实验前60 min，将小鼠移至安静的测试房，以缓解动物紧张情绪。实验时将小鼠置于直径15 cm，水深10 cm,水温(20±2)℃的上方开口圆柱形玻璃容器中，实验持续6 min，前2 min统计小鼠不动前的潜伏期时间，后4 min统计小鼠不动的总时间，全程通过高清数码摄像机记录实验过程[9]。

1.2.2.3 NSFT 实验前1 d将实验小鼠换至新鼠笼，24 h后进行测试。实验前60 min，将小鼠移至安静的测试房，实验时将小鼠置于40 cm× 40 cm×40 cm的上方开口的玻璃盒中，在玻璃盒的中央放置一白色器皿，其上放一颗鼠粮，从把小鼠放入玻璃盒中开始计时至小鼠开始进食为止，实验持续5 min,若5 min内小鼠无进食，则记为5 min，全程通过高清数码摄像机记录实验过程[10]。

1.2.2.4 OFT 实验前60 min,将小鼠移至安静的测试房并打开软件记录日期，小鼠标号后进行测试，实验时将小鼠置于旷场实验装置60 cm×60 cm×60cm中心区域，通过旷场设备上方的摄像机及其相连的监视器观察5 min内小鼠的活动情况，包括休息时间、运动距离与速度，进入中心区域的次数和时间，实验结束后将小鼠放回笼内，用75%乙醇彻底擦拭实验装置，并用纸巾擦干[11]。

1.2.3 取材 实验结束后，用配制好的10%的水合氯醛(10 μL/g)进行腹腔注射，待小鼠麻醉成功后剖开胸腔，从左心室插管，用加入肝素的生理盐水进行心室灌注，灌注速度为8 mL/min。待肝脏颜色由粉红变透亮后取出全脑或立即分离海马、额叶和杏仁核组织，全脑组织立即固定于4%多聚甲醛溶液中进行免疫组化染色(immunohistochemistry,IHC)，分离的各个脑区的组织液氮冻存用于RT-PCR检测。

1.2.4 IHC染色 4%多聚甲醛固定的小鼠大脑经过30%蔗糖脱水3 d，冰冻切片40 μm脑片浸泡于磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline,PBS)中，换成含3% H2O2PBS孵育10 min。用PBS洗一遍，加入封闭液(30 mg/mL 5%封闭液)，20%山羊血清(1xPBS)摇床孵育1 h。吸去封闭液，加入稀释的IBA1一抗，摇床孵育过夜。用PBS洗3遍，加入相应的二抗(辣根过氧化物酶标记)，摇床孵育2 h。用PBS洗3遍，加入二氧基联苯胺显色液显色5 min，然后将脑片在PBS中贴到阳离子包被的载玻片上，晾干后经乙醇梯度脱水二甲苯透明后用中性树脂封片。

1.2.5 RT-PCR检测 RT-PCR检测额叶、海马及杏仁核中IL-1β、IL-6和TNF-α含量水平。

1.2.5.1 RNA抽提 取液氮冷冻右侧海马组织匀浆Trizol试剂盒(Promega)抽提总RNA。

1.2.5.2 反转录合成cDNA 取1 μg总RNA,按照反转录试剂盒(Transgen)说明书逆转录合成cDNA。

1.2.5.3 实时定量PCR cDNA用UltraSYRB supermix with ROX1(康为世纪生物技术有限公司)进行PCR扩增，定量反应在Agilent Technologies Mx3005P定量PCR仪上进行。反应条件：94℃预变性3 min，94 ℃变性5 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸10 s，共进行40次循环。PCR引物由primer bank以及在线Primer 3.0软件设计，订购于Life Technologies公司。引物序列分别为：IL-1β，上游引物GCAACTGTTCCTGAACTCAACT，下游引物ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT；IL-6,上游引物TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC，下游引物TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC；TNF-α，上游引物CCCTCACACTCAGATCATCTTCT，下游引物GCTACGACGTGGGCTACAG。

2 结果

2.1 三氧预防性干预 预防性干预时间如图1A。

2.1.1 行为学结果 在TST、FST、NSFT及OFT中，对照组与对照加三氧组各项行为学测试差异无统计学意义(F=4.056，P>0.05)。

2.1.1.1 TST 模型组不动之前的潜伏期时间较对照组短(F=2.303,P<0.05)，模型组潜伏期时间较模型加三氧组短(F=3.478,P<0.05)(图1F),后4 min总的不动时间各组差异无统计学意义(F=3.807,P>0.05)(图1E)。

2.1.1.2 FST 模型组不动之前的潜伏时间较对照组短(F=3.144,P<0.05),模型组潜伏期时间较模型加三氧组短(F=3.112,P<0.05)(图1C)。模型组后4 min总不动的时间较对照组长(F=4.356,P<0.05)，模型组后4 min不动的总时间较模型加三氧组长(F=3.798，P<0.05)(图1B)。

2.1.1.3 NSFT 模型组潜伏期时间较对照组长(F=3.499,P<0.05)，模型组较模型加三氧组潜伏期时间长(F=2.809,P<0.05)(图1D)。

2.1.1.4 OFT 我们监测了小鼠行动轨迹图(图G)，运动距离与速度，休息时间，进入中心区域的次数与速度。从总区域运动距离与速度看，模型组运动距离较对照组短(F=4.528,P<0.05)，模型组运动距离较模型加三氧组短(F=2.478，P<0.05)。模型组运动速度较对照组慢(F=6.089,P<0.05)，模型组运动速度较模型加三氧组慢(F=3.125，P<0.05)(图1H、1I)。从在中心区的休息时间看，模型组休息时间较对照组长(F=3.950,P<0.05)，模型组休息时间较模型加三氧组长(F=4.908,P<0.05)(图1J)。就进入中心区域的速度来看，模型组较对照组运行速度慢(F=2.256,P<0.05)，模型组休息时间较模型加三氧组短(F=3.675,P<0.05)(图1K)。从进入中心区域的次数可以看出各组比较差异无统计学意义(F=4.997,P>0.05)(图1L)。

2.1.2 光镜观察各组小鼠同一部位海马、额叶和杏仁核的小胶质细胞形态(图2A)及数量变化 在海马、额叶及杏仁核中，对照组与对照加三氧组小胶质细胞数量差异无统计学意义(F=3.456，P>0.05)。模型组额叶区小胶质细胞数量较对照组多(F=4.361,P<0.05)，模型组额叶区小胶质细胞数量较模型加三氧组多(F=3.112，P<0.05)。模型组海马区小胶质细胞数量较对照组多(F=3.456,P<0.05)，模型组海马区小胶质细胞数量较模型加三氧组多(F=4.005，P<0.05)。各组小鼠杏仁核区小胶质细胞形态及数量比较差异无统计学意义(F=6.012,P>0.05)(图2B)。

2.1.3 RT-PCR检测小鼠脑中额叶、海马和杏仁核组织中炎症因子IL-1β，IL-6和TNF-α的水平 对照组与对照加三氧组炎症因子IL-1β，IL-6和TNF-α的水平比较差异无统计学意义(F=4.675，P>0.05)。额叶组织中，模型组炎症因子TNF-α的水平高于对照组(F=2.265,P<0.05)，模型组TNF-α的水平高于模型加三氧组(F=4.556，P<0.05)，而2组IL-6、IL-1β的水平比较差异无统计学意义(图2C)。海马组织中，模型组炎症因子TNF-α、IL-1β的水平高于对照组(F=8.038,P<0.05)，模型组TNF-α、IL-1β的水平高于模型加三氧组(F=6.007，P<0.05)，而2组IL-6的水平比较差异无统计学意义(图2D)(F=5.808,P>0.05)。杏仁核组织中，各组IL-6、IL-1β和TNF-α的水平比较差异无统计学意义(F=3.124,P>0.05)(图2E)。

图1 三氧预防性干预行为学

图2 三氧预防性干预海马、额叶、杏仁核区域小胶质细胞形态及数量

2.2 三氧治疗性干预 治疗性干预时间如图3A。

2.2.1 行为学结果 在TST、FST、NSFT及OFT中，对照组与对照加三氧组各项行为学测试结果差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2.1.1 TST 模型组总的不动时间长于对照组(F=3.765，P<0.05)，模型组与模型加三氧组总的不动时间相比差异无统计学意义(F=5.234,P>0.05)(图3E)。模型组潜伏期时间与对照组及模型加三氧组相比差异无统计学意义(F=6.096，P>0.05)(F=4.675，P>0.05)(图3F)。

2.2.1.2 FST 模型组总的不动时间较对照组短(F=4.567,P<0.05)，模型组与模型加三氧组总的不动时间相比差异无统计学意义(F=2.788，P>0.05)(图3B)。模型组潜伏期时间较模型加三氧组长(F=5.787，P<0.05)，模型组潜伏期时间与对照组相比差异无统计学意义(F=4.665，P>0.05)(图3C)。

2.2.1.3 NSFT 模型组潜伏期时间较对照组长(F=3.004，P<0.05)，模型组潜伏期时间与模型加三氧组相比差异无统计学意义(F=3.487,P>0.05)(图3D)。

2.2.1.4 OFT 我们监测了小鼠行动轨迹图(图3G)，运动距离与速度，休息时间，进入中心区域的次数与速度。从运动距离看，模型组与模型加三氧组及对照组比较差异无统计学意义(F=4.825，P>0.05)(图3H)。从休息时间看，模型组休息时间较模型加三氧组短(F=2.404,P<0.05)(图3I)。就进入中心区域的速度来看模型加三氧组与模型组比较差异无统计学意义(F=0.347,P>0.05)(图3K)。从进入中心区域的次数可以看出，模型组进入中心区域次数少于对照组(F=3.665，P<0.05)，而模型组与模型加三氧组进入中心区域次数相比差异无统计学意义(图3L)(F=1.761,P>0.05)。

图3 三氧治疗性干预行为学

2.2.2 光镜观察各组小鼠同一部位额叶、海马和杏仁核的小胶质细胞形态(图4A)及数量变化 在额叶、海马和杏仁核区域，对照组与对照加三氧组小胶质细胞数量比较差异无统计学意义(F=6.453，P>0.05)。在额叶、海马和杏仁核区域，模型组小胶质细胞数量均多于对照组(F=4.534，P<0.05)，模型组与模型加三氧组小胶质细胞数量比较差异无统计学意义(F=3.564，P>0.05)(图4B)。

2.2.3 RT-PCR检测小鼠脑中额叶、海马和杏仁核组织中炎症因子IL-1β，IL-6和TNF-α的水平 对照组与对照加三氧组炎症因子IL-1β，IL-6和TNF-α的水平相比差异无统计学意义(F=4.895，P>0.05)。额叶组织中，模型组炎症因子IL-1β、TNF-α的水平高于对照组(F=5.674,P<0.05)(F=3.022，P<0.05)，而模型组与模型加三氧组IL-1β、TNF-α的水平相比差异无统计学意义(F=1.452,P>0.05)，各组炎症因子IL-6的水平比较差异无统计学意义(F=4.052，P>0.05)(图4C)。海马组织中模型组IL-6的水平高于模型加三氧组(F=3.354，P<0.05)，模型组IL-6的水平与对照组相比差异无统计学意义(F=5.889，P>0.05)，模型组TNF-α的水平高于对照组(F=2.677，P<0.05),模型组与模型加三氧组TNF-α和IL-1β的水平相比差异无统计学意义(F=3.454，P>0.05)(图4D)。杏仁核组织中模型组TNF-α的水平均低于对照组与模型加三氧组(F=3.948，P<0.05)，模型组IL-6的水平高于对照组(F=3.044，P<0.05)，模型组与模型加三氧组IL-6的水平相比差异无统计学意义(F=4.056，P>0.05)，各组炎症因子IL-1β的水平比较差异无统计学意义(F=2.526,P>0.05)(图4E)。

图4 三氧治疗性干预海马、额叶、杏仁核区域小胶质细胞形态及数量

3 讨论

抑郁症又称抑郁障碍，是常见的精神疾病之一，主要表现为情绪低落，兴趣减低，悲观，思维迟缓，缺乏主动性，自责自罪，饮食、睡眠差，担心自己患有各种疾病，感到全身多处不适，严重者可出现自杀倾向和行为。目前治疗抑郁症的主要方法是抗抑郁药，但常见的抗抑郁药作用机制单一，且有头晕、口干，心率加快等副作用，而产生耐药反应及自杀倾向严重者则需采用电休克治疗，电休克可有效治疗重度抑郁症，但存在一定的局限性[12]。本研究探索三氧对抑郁症的预防及治疗作用。

抑郁症确切发病机制尚不清楚，大脑中小胶质细胞激活引起的神经炎症扮有重要角色。小胶质细胞是脑内常驻免疫细胞，是机体抵御损伤和感染的第一道也是最主要的防线。在正常生理情况下，它主要起到免疫监视、免疫防御和组织修复作用[13]，适度激活小胶质细胞对神经元有保护作用，但过度激活则释放大量炎性介质和神经毒性物质。有研究证实，源自小胶质细胞的促炎因子如IL-1β、TNF-α等会调制下丘脑-垂体-肾上腺皮质(hypothalamus-pituitary-adrenocorticalaxis,HPA)轴的活动，阻碍皮质激素对HPA轴的负反馈，造成HPA轴活动过度[4]，损伤情绪中枢神经可塑性[5]，降低脑中单胺类递质如5-羟色胺等的含量[6]，从而引起抑郁症发生与发展。

三氧有抗炎、抗感染、抗氧化及免疫调节等作用。有研究证实,大鼠腹腔注射三氧可减轻血液TNF-α炎症因子表达，增强超氧化物歧化酶Orgotein活性,降低活性氧水平，达到抗炎，抗氧化作用[3]。三氧可减少糖尿病肾病模型大鼠肾病组织凋亡表达，降低肾脏组织中TNF-α、缺氧诱导因子-1α水平[14]，抑制糖尿病视网膜病模型大鼠血清炎性因子释放[15]。因此我们推测三氧可能通过抑制脑小胶质细胞激活引起的神经炎症反应，从而达到防治抑郁症的目的。迄今尚未有关三氧防治抑郁症的报道。

本研究采用束缚应激法成功建立抑郁症小鼠模型，同时采用三氧干预，行为学测试发现，预防性三氧干预可有效减少小鼠抑郁行为，但治疗性三氧干预却未能减轻小鼠抑郁表型。进一步研究发现，预防性三氧干预可减少小鼠脑内海马、额叶和杏仁核区域小胶质细胞数量，降低IL-6、IL-1β与TNF-α等炎症因子水平。然而，治疗性三氧干预却未能抑制小胶质细胞的激活与炎症因子表达。

本研究发现三氧对小鼠抑郁症发生有一定预防作用，但无治疗效果，可能与下列因素有关：①三氧可有效抑制抑郁症早期神经炎症，但对小胶质细胞被充分激活后形成的神经炎症效果较差；②三氧的浓度和量可能与抑郁症防治效果相关。本研究中三氧浓度及剂量为单一的80 μg/mL，0.1 mL/10 g，结果显示对小鼠抑郁发生有一定预防效果，但无治疗作用。未来多种浓度和剂量进行干预将有利于发现三氧对抑郁作用的治疗窗口；③治疗效果可能也与给药途径有关。例如三氧大自血疗法已广泛应用于临床，三氧与血液结合后可激活免疫活性细胞，使干扰素、白介素等细胞因子的释放增加，进而增强机体免疫及抗炎能力。本研究结论仅基于三氧水腹腔注射，大自血疗法抗抑郁作用有待进一步研究。

综上所述，一定浓度和剂量三氧水腹腔注射对预防小鼠抑郁症发生有一定作用，其机制可能与减少小鼠脑内海马、额叶和杏仁核区域的小胶质细胞数量，降低小鼠脑中海马、额叶及杏仁核区域炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α表达水平有关。但本研究未发现三氧水腹腔注射对已经形成的抑郁小鼠模型有治疗效果。

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