麻醉对大鼠海水浸泡体温过低症模型的影响

奂剑波，陈丽娜，史成和，代 维，袁丹凤，周继红，韩志海

体温过低症是指机体核心温度低于35 ℃的状态，严重者可导致多器官功能障碍综合症，救治极为困难[1]。海水浸泡是导致体温过低症的重要原因，海水落水获救低温伤员与其他原因(如雪崩掩埋)导致的体温过低症相比，通常并未完全昏迷，无明显呼吸道阻塞现象等，其预后有所不同[2]。对于海水浸泡型体温过低症的研究需要建立相应的大鼠模型，现有模型多数在麻醉条件下完成，然而麻醉对于呼吸、心血管活动的抑制与低温可能有协同作用，由此带来的病理生理改变不尽相同，麻醉对建立重度体温过低症大鼠模型的影响亟待明确。本研究通过实验对比麻醉与不麻醉大鼠海水浸泡性体温过低症模型建立时的腹腔温度、活动-意识状况、呼吸、心率、肌颤、死亡率等差异，探讨麻醉对于大鼠体温过低症模型建立的作用与影响，并讨论不麻醉大鼠模型建立的可行性及适用范围。

1 材料与方法

1.1 实验动物与特殊仪器材料 雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠由第三军医大学野战外科研究所动物实验中心提供[SCXK(渝)2012-0005] ；实验方案经海军总医院动物实验伦理委员会批准；冷热恒温水槽(型号TC-LR650，上海双舜实业发展有限公司)；温度记录器(iButton,型号DS1922L，Maxim/Dallas公司生产；设置温度记录启动时间为预期低温浸泡实验前8 h，温度记录频次1/min，放入90℃融化石蜡中浸泡3 s，取出冷却，75%乙醇中浸泡消毒30 min备用)；自制大鼠水浴固定器；海盐(广州益尔生物工程有限公司，按比例配制盐度3%海水浸泡用)等。

1.2 实验方法与观察指标

1.2.1 实验前处理与分组 大鼠实验前10 d麻醉，备皮，消毒，右上腹开2 cm切口，将预处理后的温度记录器置入腹腔，缝合切口并涂抹红霉素软膏，大鼠苏醒后常规单笼饲养，每天给予青霉素钠20万U腹腔注射,连续3 d，术后连续观察10 d，选取大鼠手术切口愈合良好无感染，体重稳定增长，活动自如，饮食排便良好的40只大鼠作为实验动物，体重(286.5±10.7)g，按随机数法随机分为生理盐水腹腔注射组(对照组)和1.5%戊巴比妥钠腹腔注射组(麻醉组)，每组20只。

1.2.2 低温海水浸泡实验 大鼠称重后，麻醉组按体重30 mg/kg给予1.5%戊巴比妥钠腹腔注射，对照组按体重相应给予麻醉药相同体积生理盐水腹腔注射，10 min待麻醉组完全麻醉后将2组大鼠同时放入自制大鼠水浴固定器内，然后置入(15±0.2)℃盐度3%海水中浸泡，浸泡深度为锁骨水平，每10 min观测并记录1次大鼠活动意识状况(分级标准见后)、呼吸频率、心率、肌颤频率等，浸泡2 h后，每30 min观测上述数据，如死亡记录死亡时间；浸泡实验结束后，处死大鼠，取出温度记录器，用专用仪器和软件读取腹腔温度数据。

1.2.3 SD大鼠活动意识简易分级标准 分为7级：应激反应激烈，活动显著增强；6级：较平静状态，活动稍加强；5级：平静稳定，活动自如；4级：意识稍微抑制，活动度减低；3级：无明显活动，对轻刺激有反应；2级：无活动，对强刺激有反应；1级：深度昏迷，对强刺激无任何反应。

2 结果

2.1 腹腔温度 实验前对照组与麻醉组腹腔温度均正常，分别为(37.8±0.5)℃和(38.2±0.1)℃，在腹腔注射10 min后2组腹腔温度均略有下降，对照组降幅(0.7±0.5)℃明显小于麻醉组(1.8±0.5)℃(t=7.19，P<0.05)；海水浸泡后均快速下降，浸泡120 min左右逐渐接近水温，然后维持相对稳定的低温状态(将浸泡120 min前后分为体温下降期和低温维持期)。体温下降期内，2组均在10 min左右下降速度最快，且该时间点麻醉组腹腔温度小于对照组[差值为(0.9±0.3)℃，t=3.01，P<0.05] ，30 min后下降速度趋缓，2组间差值逐渐减小；维持期对照组腹腔温度(15.7±0.2)℃高于麻醉组(15.6±0.2)℃(t=3.72，P<0.05)，见图1A。典型单个大鼠腹腔温度连续变化曲线见图3。

2.2 活动意识等级 实验前对照组与麻醉组中位活动意识等级均为5级，腹腔注射后对照组升至6级，而麻醉组降至3级；海水浸泡后对照组先迅速上升至7级，维持20 min左右，后快速下降并于60 min时降至3级，继而阶梯式缓慢下降，于300 min时降至1级，而麻醉组中位活动意识等级则持续阶梯式下降，于40 min左右降至2级，80 min左右降至1级。体温下降期对照组中位活动意识等级均大于麻醉组，差异先增大后减小，10 min时2组差异最大(分别为7级和3级，Z=5.94，P<0.05)；维持期2组中位活动意识等级差异明显(分别为2级和1级，Z=9.11，P<0.05)，见图1B。

2.3 心率 实验前对照组与麻醉组心率均正常，分别为(366.0±26.4)/min和(397.8±16.6)/min，腹腔注射10 min后对照组升高了(32.5±23.2)/min，而麻醉组降低了(49.8±7.7)/min(变化幅度对比，t=15.08，P<0.05)；海水浸泡后对照组继续升高，于10 min左右达到峰值，然后先快速下降后缓慢下降，至浸泡120 min时在较低水平维持相对稳定，而麻醉组心率在浸泡过程中持续下降，下降速度先快后慢，至浸泡120 min左右低水平维持相对稳定。整个浸泡过程中各时间点对照组心率均大于麻醉组，差值先增大后变小，10 mim时2组差值最大(156.0±8.7)/min(t=17.83，P<0.05)；维持期对照组心率(81.0±10.4)/min仍高于麻醉组(55.9±6.7)/min(t=15.49，P<0.05)，见图1C。

2.4 呼吸频率 实验前对照组与麻醉组呼吸频率均正常，分别为(85.4±11.0)/min和(90.9±3.4)/min，腹腔注射10 min后对照组升高了(5.9±5.4)/min，而麻醉组降低了(9.4±2.5)/min(变化幅度对比，t=11.5，P<0.05)；海水浸泡后对照组升高，于10 min左右达到峰值，然后先快速下降后缓慢下降，至浸泡120 min时在较低水平维持相对稳定，而麻醉组在浸泡过程中持续降低，速度先快后慢，至浸泡120 min左右低水平维持相对稳定。整个浸泡过程中各时间点对照组呼吸频率均大于麻醉组，差值先增大后变小，10 min时2组差值最大为(44.1±3.7)/min(t=12.05，P<0.05)；维持期对照组呼吸频率(18.5±2.4)/min仍高于麻醉组(13.9±1.4)/min(t=13.7，P<0.05)，见图1D。

2.5 肌颤频率 实验前对照组与麻醉组均无肌颤产生，腹腔注射后2组仍无肌颤。海水浸泡后，对照组全部、麻醉组大部分(85%)大鼠出现肌颤，频率均逐渐升高，对照组升高速度较麻醉组快，2组峰值均在浸泡20 min左右出现，对照组(46.5±11.8)/min明显高于麻醉组(2.8±3.2)/min(t=15.99，P<0.05)，后2组肌颤均逐渐下降，对照组于110 min肌颤完全消失，晚于麻醉组(80 min)，见图1E。

2.6 死亡率 实验过程中对照组首只大鼠死亡时间(80 min)晚于麻醉组(60 min)；对照组死亡率(35%)明显低于麻醉组(75%)(χ2=6.47，P<0.05)；对照组中位死亡时间(165 min)晚于麻醉组(115 min)(图2)。

图1 SD大鼠低温海水浸泡生命体征观察注：图中时间点“-10 min”为腹腔注射生理盐水或者1.5%戊巴比妥钠前，“0 min”为入水浸泡前，其余为浸泡后时间点

图2 SD大鼠低温海水浸泡生存曲线

图3 典型腹腔温度连续变化曲线

3 讨论

海水浸泡性体温过低症在现代海战中发生率较高，伤情较重，是海战伤救治研究的重要内容[3]。麻醉与否是区别意外性体温过低症和治疗性低温的一个重要特征，通常麻醉状态下程序化的低温处理对于人体的损伤明显小于野外环境中低温对人的直接损伤，故在建立大鼠模型研究海水浸泡性体温过低症时需要对是否麻醉进行谨慎的思考[4]。采用不麻醉大鼠进行动物实验涉及动物伦理，本研究中我们将不麻醉大鼠采用自制水浴固定器固定，尽可能减少了其对于低温海水环境应激，同时由于低温本身的“麻醉”效应，意识逐渐散失，其在死亡前很长时间内感受的伤害痛苦值可认为较轻，符合动物实验伦理要求；另外，该固定器还有效防止大鼠海水浸泡时的淹溺。建立不麻醉大鼠体温过低症模型，核心温度的监测采用传统的麻醉时测温方式显然是不合适的，本团队预实验中利用电子温度探针同时检测低温海水浸泡大鼠肛门、腹腔、胸腔温度，发现腹腔温度较肛门温度更接近胸腔温度，更能反映机体核心体温。杨明等[5]利用连续温度记录系统回顾性描绘了不麻醉达乌尔黄鼠冬眠期间腹腔温度变化曲线，本研究将该方法成功运用到不麻醉大鼠低温海水浸泡实验中，获取了不麻醉大鼠的连续腹腔温度变化曲线，避免了频繁测温对于不麻醉大鼠低温浸泡实验的影响。大鼠比人更能耐受低温，人核心体温(通常指肛温)达到28 ℃以下时即为重度体温过低症[1]，而在此核心温度下大鼠的生存几乎不受影响；科学家们习惯将大鼠的肛温下降至15 ℃左右作为重度体温过低症的标准，低温维持时间0.5～10 h不等[6-8]。本研究中麻醉与不麻醉大鼠模型腹腔温度最终均稳定在15～16 ℃，属于重度海水浸泡性体温过低症模型。

研究发现建立海水浸泡体温过低症过程中麻醉不仅对意识产生了直接的抑制作用，同时也使大鼠腹腔温度曲线发生了细微的变化，不仅使主动活动消失，同时也使被动肌肉收缩发生困难，另外对于呼吸和心血管系统的影响无论在体温下降期还是低温维持期都是明显而且巨大的，最终大大提高了海水浸泡体温过低症大鼠的死亡率，并使中位死亡时间提前。主要原因为，戊巴比妥钠作为常用实验动物麻醉用药，具有拟γ-氨基丁酸的作用，能与中枢神经系统的突触后膜γ-氨基丁酸受体结合，在没有γ-氨基丁酸时大剂量戊巴比妥钠能直接活化Cl-通道，Cl-的大量内流使突触后膜发生超级化，进而降低突触后神经元的兴奋性，并主要在中枢神经系统抑制脑干网状结构上行激活系统，达到催眠、镇静效果，同时对呼吸和循环也有显著的抑制作用[9]。有趣的是，与不麻醉相比，虽然麻醉大鼠主动、被动活动(肌颤)被抑制，呼吸、心血管功能减弱，理论上麻醉大鼠的体温下降比不麻醉大鼠更快，然而本研究中体温下降过程中麻醉组较对照组腹腔温最大差异仅约0.9 ℃，麻醉对于SD大鼠海水浸泡时腹腔温变化差异并无想象中明显，且低温海水浸泡初始阶段腹腔温均呈现断崖式下降，未出现显著的体温代偿效应。原因可能为，SD大鼠相对于大动物或者人体重轻、体壁薄，机体与外界热量交换缺乏纵深，难以代偿低温海水对于热量的汲取，由于海水良好的导热性能，浸泡海水温度与体壁厚度成为了核心温度下降速度的决定因素，其主动或者被动的生理产热对温度曲线变化的影响相对降低，在大动物或者人类，由于体壁厚、主动活动代偿等，体温下降曲线可能呈反S下降的过程，需要后续实验进一步验证。鉴于麻醉对建立重度海水浸泡体温过低症大鼠模型的巨大影响，我们在进行相关研究时需要根据研究目的对2种大鼠模型进行对比选择。

目前常用麻醉大鼠建模[7, 10]，麻醉大鼠具有操作便利、测温方式选择多样、检测指标容易等优点，然而不麻醉大鼠在反映真实海水浸泡低温损伤时具有优势，且在某些研究方向难以被麻醉大鼠替代。首先，意识状况是体温过低症分级的重要参考依据，重度体温过低症伤员意识均模糊或者消失，细化海水浸泡体温过低症分级标准时需要在实验中保持大鼠处于清醒状态，同时重度体温过低症伤员救治成功后神经系统的改变也是研究热点之一[11]，不麻醉大鼠模型在研究低温与神经意识相互关系时具有优势。其次，应激反应在低温海水浸泡损伤中扮演重要角色，人体落水时促肾上腺皮质素、糖皮质激素、甲状腺素、胰高血糖素等均分泌增高[12]，机体由此发生一系列相应变化，然而随着低温维持时间延长其变化趋势不甚明了，其对体温过低症的救治影响较大，均需要以不麻醉大鼠来进行研究。另外，麻醉虽然对于海水浸泡大鼠体温下降及低温维持阶段的温度变化曲线影响不大，但是由于其对能量代谢的影响固定存在的，这种影响反而更易在脱离低温海水浸泡环境中表现出来，很可能对于大鼠体温恢复能力的产生影响，加之麻醉与否还与自身活动导致能量物质贮备的消耗有关，不麻醉大鼠更能模拟体温过低症复温过程中能量代谢变化趋势，对于海水浸泡体温过低症的救治更加具有现实指导意义。

综上所述，麻醉对建立重度海水浸泡性体温过低症大鼠模型影响较大，麻醉与不麻醉大鼠模型在研究海水浸泡体温过低症时各有优缺点，不麻醉大鼠模型在低温与神经系统相互关系、低温与应激反应、复温时能量代谢等方面的研究更具优势。

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