6种磺胺类抗生素的液相色谱法分析条件及优化

张博翔，班龙科，周睿，桂荣洁，张瑾

(安徽建筑大学 环境与能源工程学院，安徽 合肥 230601)

0 引言

磺胺类抗生素(sulfonamides antibiotics，SAs)，因结构中有氨苯磺胺结构而被称为SAs类抗生素。该类抗生素具有抗菌性强、稳定性高、价格低、使用方便、可大量生产等优点而被广泛应用于人体疾病和临床兽医治疗细菌和真菌性疾病，是一种在世界各国的抗生素销售及使用量中均居于首位的人与动物共用药品。SAs的生产具有不以农作物作原料、产量高、种类多等优点，故在治疗感染性疾病的药物中占有一定地位[1-3]。然而，大量的生产和应用，也导致了SAs在环境中的残留。据报道，SAs是目前水体中检出率较高的一类抗生素污染物[4-6]。

进入环境中的SAs将对环境中的生物生存产生影响。研究显示，当种植蔬菜的土壤被抗生素污染时，蔬菜可以直接吸收土壤环境中的SAs，土壤中SAs的浓度越高，蔬菜吸收的量相对越多[7-8]。使用含有抗生素的饲料喂养动物时体内都会有所残留，抗生素会通过食物链向食物链顶端传递，人类或其他食肉动物在食用有抗生素的食物后，体内也会积蓄抗生素而另一部分经由人与动物的粪尿排出体外，进入生态环境[9-10]。SAs抗生素存在副作用，人体内或是动物体内长期积累大量的磺胺类药物会出先耐药性，过敏等症状，甚至可能致癌，但我国并未对抗生素药物严格控制。

目前用于磺胺类抗生素的检测方法有很多，主要有气相色谱法，高效毛细管电泳法，高效液相色谱法，紫外光谱法等[11]。液相色谱法是一种高效的分析技术，可以迅速有效准确地分析出其内部结构，特别是对于有机化合物的检测，可以显著展现它迅速、精准的特点[12]。目前，使用液相色谱技术检测抗生素的残留研究相对较少，其色谱条件尚不完善，因此，开展液相色谱的色谱条件的研究是有重要的实际意义。

因此，本文拟选择六种较常见的SAs抗生素:磺胺嘧啶(sulfadiazine，SD)，磺胺吡啶(sulfapyridine，SP)，磺 胺 氯 哒 嗪 (sulfachloropyridazine，SCP)，磺胺喹噁啉(sulfaquinoxaline，SQ)，磺胺二甲嘧啶(sulfadimidine，SM2)，磺胺甲噁唑(sulfamethoxazole，SMZ)为研究对象，应用液相色谱进行色谱条件的分析，建立六种抗生素的分析方法，并进行优化，采用面积归一法得到六种抗生素的线性回归方程，研究结果可为环境中磺胺类抗生素残留分析方法提供参考。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

试剂:6种抗生素:磺胺嘧啶(SD)，磺胺吡啶(SP)，磺胺氯哒嗪(SCP)，磺胺喹噁啉(SQ)，磺胺二甲嘧啶(SM2)，磺胺甲噁唑(SMZ)，均购自上海原叶生物科技有限公司，基本理化性质见表1，色谱级甲酸购自天津市光复精细化工研究所。

仪器:液相色谱仪(滕州鲁南分析仪器公司)、紫外-可见吸收光谱仪(日本，TU1901)、超纯水机(上海富诗特仪器设备有限公司)、单道可调移液器(10-100 μL)(大龙兴创实验仪器有限公司) 。

1.2 色谱条件

色谱柱:C18，三种流动相分别是:甲醇-0.1%甲酸溶液(V∶V=60∶40)，甲醇-0.1%甲酸溶液(V∶V=40∶60)，甲醇-0.1% 甲酸溶液(V∶V=80∶20)，流速:1 mL/min，检测波长 λ=270 nm，柱温40℃。

1.3 流动相的配置

将甲酸和超声水用砂芯过滤装置进行过滤，过滤后配置成0.1%甲酸溶液，将过滤的甲醇溶液与0.1%甲酸溶液分别按照三种浓度比例混合，分别是V∶V=60∶40，V∶V=40∶60，V∶V=80∶20混合，将混合的溶液超声波10分钟，存于4℃冰箱中备用。

表1 6种抗生素的基本理化性质

1.4 标准溶液的配置

准确称取 SD、SP、SCP、SQ、SM2、SMZ 等 6 种抗生素标准品各1.0 mg分别于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇(LC)溶解并定容，将其配置成100 mg/L的标准溶液，避光存于4℃冰箱中。分别将6种磺胺类抗生素标准溶液稀释至 0.01、0.1、0.5、1、5、10 mg/L浓度的储备液，避光存于4℃冰箱中备用。

2 结果与分析

2.1 检测波长选择

以甲醇(LC)溶液作试剂空白，应用紫外-可见吸收光谱仪扫描六种抗生素磺胺嘧啶(SD)，磺胺吡啶(SP)，磺胺氯哒嗪(SCP)，磺胺喹噁啉(SQ)，磺胺二甲嘧啶(SM2)，磺胺甲噁唑(SMZ)溶液的紫外吸收光谱图如图1所示。从图1中可以看出在210 nm时，波峰的重复性较差，而且后面还有相对密集波峰存在。如果选择210 nm则会导致检测峰面积有较大差异，然而在 270 nm时SD、SP、SCP、SQ、SM2、SMZ的波峰重叠效果最好且最大吸收波长为270 nm，所以选择270 nm作为检测波长。

图1 6种磺胺类抗生素(5 mg/L)的紫外吸收光谱图

2.2 流动相构成的确定

从图2中可以看出，选择甲醇-0.1%甲酸溶液(V∶V=40∶60)作为流动相时，样品的组分吸收低于流动相出现负峰情况[13]，当增加甲醇的用量选择甲醇-0.1%甲酸溶液(V∶V=60∶40)作为流动相，可以得到满意的分离结果。为了继续探究更好的分离效果我们又继续增加甲醇的用量选择甲醇-0.1%甲酸溶液(V∶V=80∶20)作为流动相，但是导致溶剂峰与样品峰重叠使分离效果不理想。因此，流动相确定为甲醇-0.1%甲酸溶液(V∶V=60∶40)的混合溶液。

2.3 流动相条件的进一步优化

由图3可以看出以甲醇-0.1%甲酸溶液(V∶V=60∶40)作为6种SAs检测流动相的效果最好，虽然SP和SD的效果不是特别理想，但不影响检测结果，为了能同时检测6种SAs所以最终确定采用甲醇-0.1%甲酸溶液(V∶V=60∶40)作为6种SAs检测流动相。

2.4 保留时间

应用优化的色谱条件，测定事先已配好的六种抗生素 SD、SP、SCP、SQ、SM2、SMZ 的标准使用液，进样量为20 μL，运行时间为10 min，该色谱条件下6种抗生素的保留时间如下表2。

表2 6种抗生素的保留时间

2.5 线性关系

应用优化的色谱条件，分析一系列不同浓度的 SD、SP、SCP、SQ、SM2、SMZ 标准储备液，进样量20 μL，以峰面积为Y(mv)为纵坐标，质量浓度X(mg/L)为横坐标的到6种抗生素的线性回归方程，并以信噪比为3确定了检出限，具体数据见表3。从表中，可看出六个抗生素的线性方程的相关系数R2均到达0.9以上，与文献[14-15]中应用高效液相色谱法(乙晴为流动相)获得的磺胺抗生素线性方程的相关系数0.993(SAs)的接近。但本实验仪器和材料较文献中用高效液相色谱法且流动相为昂贵的乙晴等更加经济、易得，同时也能达到准确效果，说明该方法的合理性和实用性较好。

表3 6种抗生素的线性方程

图2 6种磺胺类抗生素在3种不同流动相下检测的液相色谱图 注：横坐标为时间(min)纵坐标为电压(mv)

3 结论

本文建立了6种SAs:磺胺嘧啶(SD)，磺胺吡啶(SP)，磺胺氯哒嗪(SCP)，磺胺喹噁啉(SQ)，磺胺二甲嘧啶(SM2)，磺胺甲噁唑(SMZ)的液相色谱分析方法，并对分析方法进行了优化，得到最佳色谱条件为:流动相甲醇-0.1%甲酸溶液(V∶V=60∶40)，流速为 1 mL/min，检测波长 λ=270 nm，柱温40℃，最终获得了六种磺胺类抗生素的线性回归方程，其线性相关性R2值分别为0.9810，0.9980，0.9910，0.9980，0.9998，0.9970，六个抗生素的标准曲线的相关系数值R2均在0.9以上。该方法可用于环境中SAs的含量检测，也可为其它抗生素的分析提供提供方法参考。

图3 6种磺胺类抗生素在甲醇-0.1%甲酸溶液(60∶40)流动相下检测的液相色谱图