携抗纳米超声造影剂对动脉粥样硬化的诊断研究

孟祥祎，张云杰，陈雨欣，高 嵩，张向宇

(佳木斯大学药学院，黑龙江 佳木斯 154007)

以内充气体的微泡为载体，携带抗体的主动性靶向超声造影剂，经过静脉注射通过血管到达各组织器官，可以显著增强病变部位和正常组织的对比度，在超声分子成像和血管疾病靶向治疗中有着重要的意义[1-2]。动脉粥样硬化是心血管系统常见病，危害严重，以动脉粥样斑块形成为典型特征，因此早期准确识别易损斑块是预防和治疗动脉粥样硬化的关键措施。VEGFR-2 作为重要的血管内皮生长因子(VEGF)的主要受体，高表达于易损斑块新生血管的内皮细胞[3-4]。常规超声造影剂平均直径为2～4μm，能自由通过肺循环，但不能透过血管内皮，临床应用有一定局限性。而纳米级超声造影剂粒径更小，穿透力更强，能够通过血管内皮，在特定的病变部位聚集，提高超声诊断的准确性和特异性[5-6]。根据这些机制，我们的实验研究借助生物素-亲和素的桥连作用，将抗体 VEGFR-2 整合于纳米级微泡造影剂表面，构建具有特异性诊断斑块新生血管的靶向超声造像剂，使该纳米微泡选择性高浓度聚集于易损斑块产生靶区显影增强，为其今后的载药治疗研究提供依据 。

1 实验材料和方法

1.1 实验材料

大豆磷脂；吐温-80；六氟化硫气体；二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺-聚乙烯二醇2000-生物素；链亲和素；生物素化小鼠抗兔 VEGFR-2 单克隆抗体；FITC标记山羊抗小鼠二抗。

1.2 实验仪器

电子天平、磁力搅拌器、超声细胞粉碎仪、高速离心机、投射电子显微镜、激光粒度分析仪、荧光显微镜、流式细胞仪、彩色多普勒超声诊断仪。

1.3 实验动物

健康新西兰大白兔2只，平均体质量2.2 kg ,每日给予高胆固醇蛋黄3个喂养4周, 采用高脂饮食损伤血管内皮。

1.4 制备方法

采用超声乳化法制备纳米级脂质微泡[7]。配制含1%吐温80的生理盐水20mL，取生物素化的DSPE-PEG(2000) 0.02g和大豆磷脂0.1g溶于该溶液，再加入0.04 g DMPC使磷脂常温下充分溶胀。在细胞粉碎仪中超声乳化2min(50W，40 kHz)，制备过程中持续通入SF6气体。制得的纳米微泡放在4℃的冰箱中5h静置分层，弃去上层大粒径微泡，收集中下层溶液洗涤，重悬制得纳米级微泡造影剂。采用生物素-亲和素法制备靶向微泡[8]，首先将链亲和素加入制备好的生物素化微泡中孵育1h，离心，洗涤3次，得到亲和素-生物素化微泡造影剂。然后将生物素化 VEGFR-2 单抗与亲和素-生物素化微泡造影剂孵育过夜，最后与 FITC 标记的山羊抗小鼠 IgG 稀释液混合，在37℃孵育1h，得到荧光标记 VEGFR-2 靶向纳米级微泡造影剂。

1.5 微泡表征

用投射电子显微镜观察靶向微泡和空白微泡的结构、粒径和形态；用激光粒度分析仪分析粒径大小及分布；荧光显微镜下观察靶向微泡与抗体结合率；将靶向微泡和空白微泡各 1ml，以稀释液稀释至流式细胞仪检测其配体携带率。

1.6 体内超声成像

经兔耳缘静脉注射麻醉动物，兔备皮后仰卧位固定于操作台上暴露腹部扫查部位。用头皮针经尾静脉建立静脉通道后注入纳米微泡0.5mL/kg,，随后尾注生理盐水冲洗管道。调节彩色超声诊断仪，采用腹部探头普通造影模式，探头频率 2～5 MHz；观察动脉内膜面有无斑块形成、斑块部位、斑块大小和回声特点。

2 结果

2.1 微泡形态、形貌观察和粒径分析

利用投射电子显微镜观察微泡的形貌。靶向微泡分布均匀，分散性较好 (图1a)。粒径小于700 nm的纳米级微泡造影剂可穿越肿瘤组织血管内皮间隙到达肿瘤靶区，在肿瘤组织中富集而实现被动靶向[9]。用激光粒度分析仪分析其粒径分布(图2b)为416±78nm，符合作纳米级造影剂的粒径要求，也证实了投射电子显微镜的测量结果。

2.2 微泡荧光标记观察

结合了FITC 标记的山羊抗小鼠 IgG的纳米级磷脂微泡在光学模式图2(a)中，微泡分散度较好，粒径符合激光粒度分析仪的测量结果。在荧光模式图2(b)中，绝大多数微泡表面可见明亮的黄色环状荧光，而微泡以外的背景无荧光显示，表明微泡已经成果标记上靶向抗体。应用流式细胞仪测试抗体的结合率为42.71%。

2.3 体内超声成像实验

作为超声造影剂的一个最重要的应用是能够增强超声诊断信号的回波强度，首先，不注射造影剂，如图3(a)，在图像中回声很低，可以从回声信号中观察到管内、血管壁和血管外。另外，在白色箭头所指的位置，能够看到血管内皮的增厚现象。但是在超声二维图像上，无法观察到更有说服力的证据。

为了证实自制的超声造影剂的对比成像能力，我们注入1mL的0.15 mL/kg自制的超声造影剂，数秒钟内在血管中出现较强的多普勒增强。如图3(b)，可以显著的增强组织间的回声。在白色箭头所指的位置所显示的图像是区别周围的，是与5(a)中白色箭头相应位置的图像，通过超声造影剂的加入可以确定动脉粥样硬化斑块的位置。证实了自制的超声造影剂具有对比成像和靶向定位斑块的能力。