铁氰化钾分光光度法测定头孢氨苄

吴 珊

(新乡学院 化学化工学院，河南 新乡 453003)

头孢氨苄(cefalexin，CEX)是一种β-内酰胺类抗生素[1]，具有抗菌谱广、无交叉耐药性、低残留、毒副作用小等特点，广泛用于临床医学、兽医界[2]。因此，对头孢氨苄的测定研究具有重要的意义。目前，已报道的头孢氨苄的测定方法有：微生物检测法[3]、高效液相色谱法[4]、光化学荧光分析法[5]、旋光法[6]等。本文以铁氰化钾为探针利用分光光度法测定头孢氨苄，并通过正交实验优化测定条件。

1 实验部分

1.1 实验方法

分别移取1.00mL、1.5×10-2mol/L的K3[Fe(CN)6]和3.00mL、1.5×10-2mol/L的FeCl3及3.00mL、1.096g/L的头孢氨苄于50mL比色管中，用新煮沸冷却的蒸馏水稀释至刻度，摇匀于50℃下反应40min，以试剂空白为参比，于700nm处测定吸光度A。

1.2 吸收光谱

通过测定吸收光谱可以得出，Fe(III)在420nm时有较大吸收，而在700nm处无明显吸收；普鲁士蓝的最大吸收波长为700nm；空白试剂在700nm处有比较小的吸收，而头孢氨苄在500～800nm范围内没有吸收。为了消除其他试剂对吸光度的干扰，本实验以试剂空白为参比，测定700nm处生成物普鲁士蓝的吸光度而确定头孢氨苄的含量。

2 结果与讨论

2.1 不同条件对吸光度的影响

2.1.1 三氯化铁的量对吸光度的影响

固定其它条件不变：反应温度：20℃；反应时间：30min；总体积：25mL。向七组比色管中均加入3.00mL、1.096g/L的头孢氨苄，1.00mL、1.5×10-2mol/L的K3[Fe(CN)6]。

分别向七组比色管中加入不同量的1.5×10-2mol/L的FeCl3，用蒸馏水定容至25mL。在20°C下反应40min，测得相应的吸光度。通过检测得出，吸光度随着FeCl3用量的增加先增大而后减小。头孢氨苄溶液和K3[Fe(CN)6]溶液中加入1.00mL的FeCl3(1.5×10-2mol/L)溶液时，吸光度达到最大为0.130。

2.1.2 铁氰化钾的量对吸光度的影响

固定其它条件不变：头孢氨苄(1.096g/L) 3.00mL；FeCl3(0.015mol/L) 1.00mL；温度：20℃；反应时间：30 min；总体积：25mL，向九组比色管中均加入等量的头孢氨苄， FeCl3溶液，再分别向九组比色管分别加入不同量的K3[Fe(CN)6]，用蒸馏水定容至25mL。结果表明，相应的吸光度随着K3[Fe(CN)6]的用量的增加先增大后减小。

2.1.3 温度对吸光度的影响

固定其它条件不变，向八组比色管中均加入3.00mL、1.096mol/L的头孢氨苄，1.00mL、1.5×10-2mol/L的FeCl3，1.00mL、1.5×10-2mol/L的K3[Fe(CN)6]。将八组比色管分别置于20～90℃的水浴锅中40min，结果表明，吸光度随着温度的增大而增大。

2.1.4 时间对吸光度的影响

固定其它条件不变，向九组比色管中均加入3.00mL、1.096g/L的头孢氨苄，1.00mL、1.5×10-2mol/L的FeCl3，1.00mL、1.5×10-2mol/L的K3[Fe(CN)6]，用蒸馏水定容至25mL。检测后发现在20℃下，随着时间的推移，吸光度逐渐增大。

2.2 正交实验

根据以上实验结果，选择三氯化铁的量、铁氰化钾的量、反应时间、温度这四个因素为研究对象进行正交实验。

表1 因素水平

表2 正交实验数据

极差的大小顺序为：Rd>Ra>Rb>Rc，最优方案为：A4B2C4D3。 从表中可以看出影响因素最大的是温度，取加和最大的水平作为最佳条件。得出的最优方案：3.00mL、1.5×10-2mol/L的FeCl3，1.00mL、1.5×10-2mol/L的K3[Fe(CN)6]，反应时间40min、温度为50℃。在最优方案下，利用分光光度法对头孢氨苄进行测定。

2.3 标准曲线

配制一系列头孢氨苄的标准溶液，以吸光度A与相应的c进行线性回归。头孢氨苄在80～160μg/mL范围内与A呈现良好线性关系。线性回归方程为A=0.03281+0.00749c(μg/mL)，线性相关系数R=0.9982。

图1 头孢氨苄溶液的标准曲线

2.4 精密度检测

平行测定12份试液，其吸光度A分别为0.708、0.708、0.710、0.710、0.711、0.710、0.710、0.710、0.711、0.710、0.709、0.710，由测得的A值得到其相对标准偏差为：δ = 9.57×10-4。

2.5 检出限的测定

平行测定12份试剂空白试液：在比色管加入3.00mL、1.5×10-2mol/L的FeCl3，1.00mL、1.5×10-2mol/L的K3[Fe(CN)6]，用蒸馏水定容至25mL，测得A值分别为：0.643、0.643、0.642、0.642、0.642、0.643、0.643、0.642、0.642、0.642、0.642、0.641，标准偏差σ=5.95×10-4，计算检出限为0.2384μg/mL。

2.6 样品的制备与分析

2.6.1 头孢氨苄样品的分析

分别移取2.28 mL、2.74 mL、3.65 mL的头孢氨苄溶液(1.096g/L)于3支25mL比色管中，依次向每支比色管加入3.00 mL FeCl3溶液、1.00 mL K3[Fe(CN)6]溶液，用蒸馏水定容后在50°C恒温水浴中加热40 min，然后对同一浓度的样品平行测定3次，进行加标回收实验(参比为不含药品的空白试剂)，如表3。

2.6.2 牛奶样品的制备及牛奶中头孢氨苄的测定

分别移取1.00mL新鲜纯牛奶至4个小烧杯中，再移取1.84mL、1.096g/L的头孢氨苄溶液至1、2、3号烧杯，移取1.00mL、pH值=4.6的HAc-NaAc缓冲溶液至4个小烧杯，混合均匀后静置10min。

对混合溶液进行抽滤，将抽滤后的清液倒入25mL比色管中，再用缓冲液冲洗抽滤瓶，将冲洗液也倒入比色管中，分别移取0.46mL、0.86 mL、1.76mL的头孢氨苄溶液(1.096g/L)于1、2、3号管中，再依次加入3.00mLFeCl3、1.00mLK3[Fe(CN)6]，用蒸馏水定容后在50°C恒温水浴中加热40min，以4号比色管为参比，对同一浓度的样品平行测定3次，进行加标回收实验，测定结果如表4。

表3 样品及回收率的测定

表4 牛奶中样品及回收率的测定

本文采用分光光度实验对头孢氨苄进行分析，在铁氰化钾存在条件下，头孢氨苄可将三氯化铁中的Fe(III)还原为Fe(II)，生成的Fe(II)与铁氰化钾反应生成可溶性的普鲁士蓝。实验结果表明此法可直接用于片剂头孢氨苄含量的测定；同时，也可应用于对牛奶中头孢氨苄残留的检测，该方法的建立对实现牛奶质量的监测具有重要现实意义。