比色法辅助下紫外分光光度法测定黄芪总黄酮含量

陈凌霆，赵娅敏，齐燕姣，罗兴平，康淑荷，张丽丽，俞布仁,杨文亮

(1.西北民族大学化工学院，甘肃 兰州 730000;2.西北民族大学甘肃省高校环境友好复合材料及生物质利用省级重点实验室，甘肃 兰州 730000;3.西北民族大学电气工程学院，甘肃 兰州 730000)

豆科植物黄芪(Radix Astragali)是世界上最受欢迎的补气药物之一，用于强化气[1]传统上，黄芪通常由黄芪或桔梗变种的干燥根制备而成，具有强心，保肝，降血脂，抗菌消炎等活性[2]。本文以甘肃榆中县产地的黄芪中药为研究对象，芦丁作为对照品，测定波长为512nm，在显色法的辅助下，采用紫外-分光光度法测定中药黄芪中总黄酮含量，拟建立测定黄芪中总黄酮含量的简便高效方法，为黄芪的进一步研究与开发提供一定的参考依据。

1 仪器与试剂

1.1 仪器

瑞士梅特勒电子天平(AB204-S)；分光光度计(T6)；旋转蒸发仪(DFT-200)等。

1.2 药品

芦丁对照品(上海融禾医药科技发展有限公司)、黄芪(甘肃榆中药店)经西北民族大学化工学院齐燕姣教授鉴定为膜荚黄芪；实验室常用药品、试剂，为分析纯。

2 方法与结果

2.1 总黄酮含量的提取

准确称取2.000g被粉碎黄芪后于回流装置中用95%乙醇(料液比1∶10)，80℃温度下回流1h，冷却过滤；用石油醚萃取1-2次，萃取剂用量约为提取液的一半，蒸发浓缩，定容，制得供试品溶液。

2.2 对照品溶液的制备

准确称取芦丁标准品5mg，烘干后置于容量瓶(50mL)中，加50%乙醇水浴加热溶解并定容，即得芦丁标准溶液(0.1mg/mL)，放入冰柜备用。

2.3 最大吸收波长的确定

显色剂(5%NaNO3-8%Al(NO3)3-5%NaOH)显色后，在空白组对照下，测得供试品溶液的最大吸收波长，由图1可知，在460～560nm范围内最大吸收波长为512nm。

图1 最大吸收波长曲线

2.4 芦丁标准曲线的制作

分别量取标准溶液0.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0mL，置于容量瓶(50mL)，用50%乙醇加至25mL，加1.5mL NaNO2溶液(5%)，摇匀，放置3min，加入10%Al(NO3)3溶液1.5mL，摇匀，放置3min，再加入5mL 5%NaOH溶液，静置5min，用50%乙醇定容；以0.0mL标准溶液组作为空白对照组，在512nm波长紫外光下测定吸光度，并绘制标准曲线(图2)，结果表明芦丁对照品浓度0.015～0.6mg/mL时，线性关系良好。

2.5 实验条件的优化

总黄酮测定中常用的显色试剂为NaNO2、Al(NO3)3与NaOH。而影响供试品溶液显色的因素有很多，如用于显色的化学试剂的选择、温度、作用时间等对吸光度的测定均会有一定的影响。另有相关研究[3-4]表明，NaNO3-Al(NO3)3-NaOH显色剂在测定植物总黄酮含量中显色效果良好，加入pH缓冲液和Al3+离子溶液，显色效果良好，因此本次试验通过对显色剂浓度、碱性溶液浓度的改变来确定最佳条件。

2.5.1 Al(NO3)3浓度的选择

移取供试品溶液，按照“2.4”方法，加入系列浓度梯度值的Al(NO3)3溶液配成待测样品，探究不同Al(NO3)3溶液浓度对吸光度值之间的关系,见图1。

表1 NaOH浓度与吸光度的关系

结果表明，8%Al(NO3)3溶液条件下，测得的吸光度值最好。

2.5.2 NaOH溶液浓度影响

移取供试品溶液，按照“2.4”方法，加入系列浓度梯度值的NaOH溶液配成待测样品，探究不同NaOH溶液浓度对吸光度值之间的关系，见表2。

表2 NaOH浓度与吸光度的关系

结果表明，5%NaOH溶液条件下，测得的吸光度值最好。经过实验条件优化发现在显色条件为5%NaNO2-8%Al(NO3)3-5%NaOH时进行测定实验最佳。

2.6 精密性实验的测定

准确量取中药黄芪供试溶液，按照“2.4”项下方法制备待测溶液，以5%NaNO2-8%Al(NO3)3-5%NaOH为显色剂，在512nm波长下连续测定5次吸光度，结果见表3。

表3 精密性测定

由表3可看出RSD(%)=0.23，表明该方法精密度良好。

2.7 稳定性实验的测定

室温下吸取供试品溶液，分别在有、无光线的条件下，静置不同时间，测定其吸光度，结果见表4、表5。

表4 光线条件下稳定性的测定

表5 无光条件下稳定性的测定

按上述两表格绘图如(图3)。

图3 有光和无光稳定性测定

从表4、表5及图3可知，在有光和无光条件下其RSD(%)分别为0.50和0.37，曲线变化趋势温和，说明该实验在室温条件下40min内较为稳定。

2.8 重现性实验的测定

称取供试液5份，按照“2.4”项下方法制备待测样品，加入显色剂(5%NaNO2-8%Al(NO3)3-5%NaOH)，测定512nm处吸光度，并计算黄芪总黄酮含量，结果见表6。

表6 重现性测定结果

根据表中结果可看出，RSD(%)=2.39本方法重现性良好。

2.9 加样回收率的测定

将干燥黄芪药材6份，分成3组，每组质量分别为1g、2g、3g，并制成试剂，吸取2mL该溶液置于容量瓶(50mL)中，然后分别加入不同体积的芦丁对照品溶液，照“2.4标准曲线绘制”项下方法，加入显色剂(5%NaNO2-8%Al(NO3)3-5%NaOH)，配成待测溶液，在512nm处测定吸光度，求得平均回收率为97.6%，RSD(%)=2.47。

2.10 样品含量的测定

准确称取干燥的黄芪药材2g，将这药材分成3组制成供试品溶液，再各准确吸取20mL供试品溶液，各置于容量瓶(50mL)中，加50%乙醇定容，加入显色剂按(5%NaNO2-8%Al(NO3)3-5%NaOH)，在512nm波长下测其吸光度，并算出黄芪总黄酮含量，见表7。

表7 样品含量测定结果

结合整个实验结果分析表明，在5%NaNO2-8%Al(NO3)3-5%NaOH显色条件下，测得甘肃榆中县黄芪总黄酮平均含量为1.09%，实验回收率为97.6%。实验中的精密性、重现性、加样回收率的RSD(%)分别为0.23、2.93、2.47，稳定性在有光和无光下的RSD(%)为0.50、0.37都符合要求。

3 讨论

亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠比色法是《中国药典》中总黄酮测定常见方法，其基本的显色原理：黄酮分子中羟基可与Al3+、Mg2+发生作用，生成有色的金属络合物，即可进行定性定量分析[1]。因供试品溶液中成分比较复杂，如果只采用紫外分光光度法则存在较大误差，故实验选择紫外分光光度法和显色法相结合。本实验探究了Al(NO3)3浓度和NaOH浓度与吸光度值之间的关系，发现在一定Al(NO3)3浓度、NaOH浓度区间内，吸光度值较高，区间外的吸光度值明显较低。显色剂的浓度也是整个比色法测定黄芪中总黄酮含量实验的一个重要关键因素，由相关的文献表明显色后最大吸收波长处的吸收强度是选用显色剂的主要依据[5]，在一定范围内，AlCl3加入量的增大，吸光度反而减小，造成显色不稳定。

因此，本研究方法中显色法最佳条件为5%NaNO3-8%Al(NO3)3-5%NaOH，最大吸收波长为512nm，线性方程为A=0.0741c+0.0005，总黄酮的回收率为97.6%，相对偏差(RSD)为2.47%。此法重现性高、稳定性好、回收率高，可为今后黄芪药物开发利用提供进一步理论依据。