微生物气体发酵法转化H2/CO2气体产乙酸的研究

王镜雅，朱彬彬，周维维，王嘉磊，任 凯，应 明

(天津理工大学 化学化工学院，天津 300384)

随着我国工业的快速发展，其生产排出的废气量逐年增加，近年来造成了我国大气严重污染。尤其是冶金行业产生的废气，其主要成分为，CO(23%)、CO2(20%)、H2(2%)、N2(50%)、CH2(2%)、O2(0.4%)等。天然耗氢产乙酸菌具有特殊的厌氧乙酰-CoA途径[1-2]，其机理如图1所示，它可以利用氢解酶将H2转化为[H+]产生电子，再把2分子的CO2还原成乙酸的甲基和羧基[3]。在反应中，CO2和H2先被还原成CHO-THF，然后转化为CH2-THF，再转化为CH3-B12；在整个厌氧乙酰-CoA途径中，起关键作用的酶是一氧化碳脱氢酶(Ni-CODH)，它可以把CO2催化还原成CO，形成CO与该酶的复合物CO- Ni-CODH，然后与CH3-B12形成CH3-CO- Ni-CODH，再进一步转化为乙酰CoA后，继而生成乙酸[4]。

本课题组从兰州市皋兰县污水处理厂活性污泥中筛选得到了一株耗氢产乙酸菌WJL142，在5L磁力搅拌发酵罐中将CO2/H2转化为乙酸。实验中设计了CO2/H2发生装置，确定了工业废气最佳模拟方案。在以2g/L的酵母粉为氮源，H2和CO2通气量分别为5mL/min和10mL/min，发酵培养温度为37℃[6]，且将种子液以37℃培养8h后按照10%的比例接入到5L发酵罐的条件下，将耗氢产乙酸菌发酵培养24h后，最终得到乙酸最大量为41.6 mM[7]。

图1 厌氧乙酰-CoA途径

1 实验材料和方法

本实验发酵菌种为耗氢产乙酸菌WJL142，从兰州市皋兰县污水处理厂二级沉淀池的污泥中筛选得到[8]。

1.1 5L 磁力搅拌发酵罐气体发酵实验装置

本实验采用5 L磁力搅拌发酵罐(型号HVE-50，上海保兴生物科技公司)，进行气体发酵产乙酸实验，其容积为5L，玻璃管体，工作压力<0.1MP。该发酵罐具有温度、转速、空气流量、pH、DO、补料、消泡显示及控制功能，并且还配有空气过滤器及机械消泡浆。本实验中发酵罐初始温度设置为37℃，转速设置为100r/min，灭菌方式为高温蒸汽灭菌锅灭菌(121℃，30min)。发酵装置如图2所示。

1.2 发酵种子液的制备

首先配备500mL种子培养基，种子培养基的配方为：CHNaO2·2H2O 3.25 g/L， KH2PO40.25 g/L，K2HPO40.25g/L， MgCl2·H2O 0.3 g/L， FeCl30.25 g/L，NiSO40.016 g/L，ZnCl20.0116 g/L，CoCl·6H2O 0.0102 g/L，CuCl2·2H2O 0.005 g/L，MnCl2·4H2O 0.015 g/L[5]。配好后用0.25M的NaOH溶液调整pH值为7，加入锥形瓶中，然后用带有玻璃管的橡胶塞塞住瓶口，再将玻璃管用锡箔纸进行密封，将其放入灭菌锅中，在121℃温度下灭菌20min。灭菌完成待冷却至常温后，将其放入无菌处理后的超净工作台中。取出活化的耗氢产乙酸菌WJL142平板，吸取200μL无菌水冲刷平板上的菌落，将菌液接入灭菌冷却后的锥形瓶培养液中，反复进行3～5次。再将锥形瓶用橡胶塞密封，从被锡箔纸密封的玻璃管口处插入灭菌处理过的长针头。轻轻来回摇晃锥形瓶，使接入的菌液和种子培养基充分混合，再放入如图2所示的通气摇床中，37 ℃恒温，持续通入CO2/H2，静止培养一定时间即得到发酵种子液。

1.3 5L发酵罐气体发酵实验方法

首先配制发酵培养基4L，发酵培养基即在种子培养基中加入4g/L二溴乙烷磺酸钠(BES)，用以抑制甲烷的生成。将发酵培养基装入清洗后的发酵罐后，采用pH值为4.0和6.18两种标准溶液进行pH电极校正。用锡箔纸将滤菌膜、pH电极接头以及各管路开口处密封，在尾气排放口处，连接一个漏斗，用纱布和报纸将其包裹，将发酵罐放入灭菌锅中，除尾气排放口及平衡管外，其余管路全部密封，在121℃下，灭菌20min。

灭菌结束，待发酵罐冷却后，转移至发酵工作台，连接冷却水管路、尾气冷凝管路、温度计、pH电极。打开通气管路及冷却水。打开发酵罐主控制台，设置各发酵参数如发酵温度37℃、转速100r/min等。待发酵罐各参数到达预期发酵参数后，开始接种，在接种环火焰保护下，快速将种子液接入发酵罐，拧紧接种口，移去接种环。发酵过程中，约每两个小时取一次样。取样时，将取样管打开，并夹住尾气排放管和平衡管，用10mL无菌离心管接取发酵液。

1.4 乙酸检测方法

本实验采用高效液相色谱(L-2400 UV Detector，Hitachi)进行乙酸检测。选用XAqua C18色谱柱(5μm，250 mm×4.6 mm)，流动相为0.2 %(V/V)磷酸和乙腈混合溶液(体积之比为96.5∶3.5)，流速为1 mL/min，紫外检测波长为214 nm，乙酸的保留时间为4.222 min[6]，工作曲线方程为y=10-4x+0.0853(y：乙酸摩尔浓度，x：乙酸峰面积)，相关系数R2=0.9912。发酵样品6000r/min离心10min，取3.5mL上清液，用0.45μm滤菌膜过滤后待用。

2 实验结果与讨论

2.1 氮源对耗氢产乙酸菌WJL142发酵产酸的影响

氮是构成细胞中核酸和蛋白质的主要元素之一，细菌细胞中氮占12%～15%，是微生物生长代谢过程中不可缺少的营养物质。采用耗氢产乙酸菌进行气体发酵，CO2是唯一碳源，所以适当添加有机氮源能够促进细胞生长，提高产酸量[7]。本实验选用酵母粉作为WJL142气体发酵的氮源。进行了5批次的梯度发酵实验，酵母粉加入量分别为1g/L、2g/L、4g/L、6g/L、10g/L，发酵温度37℃，将H2/CO2以4mL/min、8mL/min的速率通入培养基，发酵24h后取样，用HPLC检测发酵液中的乙酸含量，最终实验结果如图4所示。实验结果表明，当酵母粉加入量为2g/L时，乙酸产量相对较高，约为32.38mM。在以后的单因素实验中，发酵培养基中均加入2g/L的酵母粉。

2.2 发酵温度对耗氢产乙酸菌WJL142产酸的影响

生长温度是影响细胞生长的重要因素，适宜的培养温度能提高代谢过程中酶的催化效率[6]。本研究选取了40℃和37℃两种温度，培养种子液和发酵液，进行了四次不同温度组合的发酵实验。发酵过程中均采用4ml/min、8ml/min的速率通入H2/CO2，培养基中添加2g/L的酵母粉，发酵24小时后，测定乙酸含量。实验结果如图5所示，最终实验结果表明，当种子液和发酵培养温度都为37℃时，耗氢产乙酸菌生长产酸效果最好，产酸量达到38.21mM。

2.3 CO2/H2通气量对耗氢产乙酸菌WJL142产酸的影响

本实验的研究目的是以CO2/H2为底物，利用耗氢产乙酸菌的厌氧-CoA代谢途径转化为乙酸，所以CO2是发酵过程中的唯一碳源，CO2/H2的通入量直接影响最终的乙酸含量。在实验过程中，分别采用CO2/H2通气量为3mL/min和6mL/min；4mL/min和8mL/min；5mL/min和10mL/min；6mL/min和12mL/min；7.5mL/min和15mL/min。在发酵温度为37℃，以2g/L酵母粉为氮源的条件下发酵培养24小时。利用高效液相色谱检测发酵液中的乙酸含量，通过图6分析处理对比可知，当H2和CO2通气量分别为5mL/min和10mL/min时，耗氢产乙酸菌发酵产酸含量相对较高约为38.47mM左右。

2.4 接种方式对耗氢产乙酸菌WJL142产酸的影响

2.4.2 种子液成熟度的影响

本实验的目的是为了研究种子液培养时间对WJL142发酵产酸的影响，先后进行了5组实验，种子液培养时间分别为6h、8h、10h、12h、24h。发酵过程中在预定时间内取样检测，图8为采用不同成熟度的种子液进行发酵产生的乙酸变化曲线，很明显，种子液培养8h后接入发酵罐乙酸菌增殖代谢最佳，能够产生31.7mM的乙酸。

◆： 6h ■：8h ▲：12h ●：24h

2.4.1 接种量的影响

微生物接种量的多少直接会影响最终产物的生成。为研究接种量对WJL142产酸的影响，将培养8h的种子液，分别按照7%、10%、12%、14%的接种量接入发酵培养基，按照预定时间进行取样，检测样品中的乙酸含量。最终结果如图7所示，当接种量为10%，即种子液和发酵培养基比例为1∶10的条件下，乙酸菌WJL142的发酵代谢产酸情况最好，发酵45h乙产酸量达到40.9mM。

◆ 7% ■10% ●12% ▲14%

2.5 最优条件下耗氢产乙酸菌WJL142产酸情况

通过以上实验，了解了各影响因素对WJL142发酵代谢产酸的影响，为验证在最优条件下耗氢产乙酸菌WJL142发酵产酸情况，先后进行了3组实验。首先在发酵罐中添加2g/L的酵母粉，然后将37℃培养8h后的种子液，按照10%的比例接入到发酵罐中，发酵温度同样设置为37℃，分别以5mL/min和10mL/min通入H2和CO2，按照预定的时间进行取样，并对样品进行预处理后，检测其中的乙酸含量。发酵液pH值变化如图9，最终的pH值降至4左右，整个发酵过程中的产酸量变化如图10所示，从图中可以看出，在最优条件下发酵24h后，WJL142乙酸产量可以达到41.6mM。

图9发酵液pH值变化曲线

图10 WJL142发酵乙酸含量变化曲线

3 结论

本研究在活性污泥中发现了一种耗氢产乙酸菌WJL142，它具有特殊的厌氧乙酰-CoA代谢途径，能将H2和CO2转化为乙酸。实验采用5L磁力搅拌发酵罐进行模拟废气发酵实验，实验中探究了影响耗氢产乙酸菌WJL142产乙酸的多种因素，包括：氮源、发酵温度、CO2/ H2通气量和接种方式。实验结果表明，耗氢产乙酸菌WJL142最佳发酵条件是，以2g/L的酵母粉为氮源，种子液培养要培养8h，培养温度为37℃，并按照10%的比例接入到发酵罐中，发酵温度同样设置为37℃， H2和CO2分别以5mL/min和10mL/min通入发酵罐中，发酵24h后，乙酸产量能达到41.6mM。