外泌体在结直肠癌中的作用

包久兵，史良会

（1.皖南医学院研究生院，安徽 芜湖 241001；2.皖南医学院弋矶山医院胃肠外科）

结直肠癌（CRC）是我国最常见的恶性肿瘤之一，在肿瘤导致的死亡中居第5位［1］，预计到2030年，全球CRC的发病率将增加60%［2］。对CRC侵袭及转移的分子机制及肿瘤细胞与外界信息交流的机制的了解，将有助于进一步预防和治疗CRC，其中外泌体介导的运输形式发挥着重要作用。癌细胞能释放多种囊泡，这些囊泡可以通过体液，如外周血、唾液、尿液和腹水等进行转移［3］，某些特殊的细胞囊泡称为“外泌体（exosomes）”，其与癌症的进展相关［4］。

1 外泌体

1.1 外泌体的产生 外泌体是在内化过程中由质膜产生的。首先，细胞通过内吞作用形成早期内涵体（early endosomes，EE），其逐渐变为晚期内涵体或多泡体（MVBs），MVBs膜内陷形成腔内囊泡（ILVs），MVBs与溶酶体膜融合可降解蛋白质，并且释放ILVs进入溶酶体，或者MVBs与质膜融合，ILVs被释放到细胞外环境中，称为外泌体［5］。外泌体融合了mRNA、miRNA、蛋白质和部分特定区域的DNA等。外泌体的大小在30～100 nm［6］，40～100 nm［7］，50～150 nm［8］不等。然而，外泌体的生物起源机制尚不十分清楚，还需要进行更深入的研究。

1.2 外泌体的分离方法 根据其大小、密度、含量、标记物或电位等一些自身特点，从血浆、血清、培养基中分离外泌体的方法有多种。第一种分离方法是超速离心法，因其性能高、操作简单和易获得性而被广泛应用［9］。为了从细胞培养物中分离外泌体，必须使用无血清培养基或补充除外泌体的血清培养基来避免可能对结果造成干扰。超速离心法实施方案：先将上清液以480×g离心5 min，然后再用2 000×g离心10 min，移除细胞和细胞碎片［8，10］；取离心后的上清液，用0.2 μm孔过滤除去大的囊泡，在4℃以100 000×g离心60 min；将沉淀重悬于PBS中，通过蔗糖梯度离心法，在4℃以100 000×g离心60 min进行纯化，所得含有外泌体的物质必须用PBS洗涤并储存在-80 ℃环境中［11］。

近年来，超速离心的替代方法（包括超滤［12］）与日俱增。BiooScientific研发了“ExoMir Kit”试剂盒，通过第一个微滤器（0.22 μm）移除细胞和细胞碎片等，通过第二个微滤器（0.02 μm），使用正压驱动流动并最终获取外泌体［13］。另外一种方法是：通过使用针对膜蛋白如CD9、CD63、CD81、CD82、Alix、膜联蛋白、EpCAM和Rab5的抗体来特异性分离外泌体，这些抗体被固定在层析基质或平板上［14］。值得强调的是，对于外体的分离、纯化、量化或储存，并没有一种普遍的方法。我们期待在不久的将来研究出一种普遍适用的方法，这将促进肿瘤的进一步研究。外泌体分离出来后，可以通过不同的技术如ELISA、Western blot、流式细胞术，qPCR、蛋白质组学或NanoSight等，分析其组成或定量。

2 CRC来源外泌体

外泌体可以携带致癌蛋白、肿瘤抑制因子、转录调节因子、剪接因子等多种蛋白质和RNA（mRNA、miRNA和其他非编码RNA）［8］。外泌体内还包含某些DNA片段，这可能提供有关癌细胞起源的相关信息［15-16］。此外，外泌体还可以运输和递送大量的蛋白质、脂质和核酸，并且可以修饰细胞和器官功能［4］。

目前常用下列细胞系来研究CRC，如LIM1215、LIM1863、HCT-15、SW480、SW620、DiFi和WiDr等。这些细胞系的囊泡含有高浓度的细胞黏附蛋白以及参与分子运输的蛋白和胞外基质蛋白。Ji等［8］通过免疫亲和力的方法，在LIM1863细胞系中发现了2种外泌体（E-A33和E-EpCAM），其miRNA种类具有显著差异，E-A33特异性富集了33种miRNAs，其中14种miRNAs在CRC组织分析中未曾报道过，其可能作为诊断CRC的潜在生物标记物。Mitsuru等［7］检测了CRC细胞系HCT-15、SW480和WiDr分泌的外泌体内的RNA种类，发现了管家基因ACTB mRNA和GAPDH mRNA，miR-21、miR-192、miR-221，以及LRRC24、MDM2和CDKN1A基因的天然反义RNA，这也是首次发现在外泌体内存在天然反义RNA；此外，还发现来源于CRC细胞系的PKH67标记的外来体被摄取到HepG2和A549细胞中；这些发现表明，细胞内RNA通过外泌体分泌到细胞外，并且源自CRC细胞系的外泌体能够转移至HepG2和A549细胞中，外泌体中的RNA在细胞间穿梭，可能参与调节受体细胞中的基因表达。

Ji等［10］分析比较了来自 SW480细胞系（ESW480）和其转移性SW620细胞系（E-SW620）的“外泌体”中的蛋白表达谱，发现两者均含有典型的外泌体标记物TSG101、Alix、CD63；而转移因子（MET、S100A8、S100A9、TNC）、信号转导分子（EFNB2、JAG1、SRC、TNIK）和脂质筏及其相关成分（CAV1、FLOT1、FLOT2、PROM1）选择性富集于E-SW620中；此外，在E-SW620中也发现了高水平的Src家族激酶，其与E-SW620中脂筏及其相关分子CAV1、FLOT1和FLOT2相互作用，参与了信号转导、内吞和细胞骨架重塑，提示它们在信号转导中起重要作用，可促进细胞转化和肿瘤进展。据报道，包裹在E-SW620中的七次跨膜磷酸化酪氨酸激酶可能参与调节外泌体的生命周期［17］。

KRAS基因在30%～40%的CRC肿瘤中出现了突变，Demory Beckler等［6］研究发现，与表达野生型KRAS的CRC细胞分泌的外泌体相比，表达突变型KRAS的细胞分泌的外泌体可增强受体细胞的侵袭性，进一步研究发现，KRAS突变可显著影响外泌体的蛋白质组成，突变型KRAS的细胞产生的外泌体含有多种促肿瘤蛋白，包括Src家族激酶、EGFR、整合蛋白和突变KRAS蛋白；含突变型KRAS的外泌体可被内化并将突变型KRAS转移至含野生型KRAS蛋白的DKs-8细胞中，从而促进DKs-8细胞的黏附和增殖。此外，有研究发现miR-100在含突变型KRAS蛋白的外泌体中显著增加［18］。

Lydic等［19］比较分析了CRC细胞系LIM1215和其分泌的外泌体的脂质谱，结果显示在外泌体中存在某些脂质的富集，包括鞘脂、固醇脂质、甘油脂、甘油磷脂、缩醛磷脂等。

3 外泌体在CRC细胞中的作用

3.1 参与肿瘤细胞的转化和增殖 肿瘤侵袭和转移的重要机制是上皮-间质转化（EMT）。EMT机制与癌症的发生、癌细胞侵袭、转移以及复发的早期阶段有关［20］。研究表明，肿瘤来源的外泌体可以促进受体细胞的EMT过程［21］。Bigagli等［22］研究发现，CRC细胞系HCT-8在培养7 d后，一些细胞开始在悬浮液中生长，细胞呈E-钙黏蛋白阴性和波形蛋白阳性，表明细胞具有失巢凋亡抵抗和转移潜能；通过电子显微镜分析发现，由贴壁细胞分泌的外泌体可被转移性细胞吸收，并且贴壁细胞分泌的外泌体中的miR-210水平显著高于细胞内水平，因此miR-210可能是EMT的触发信号，促进癌细胞转移。

除了影响EMT过程外，从SW620和SW480细胞系中提取的外泌体能够显著增加2F2B小鼠内皮细胞的体外增殖，从而促进肿瘤血管的生长［10］。这种对内皮细胞的影响可能与外泌体中富集细胞周期相关基因mRNA有关，这些富集的mRNA主要与细胞周期M期活性相关，在肿瘤生长和转移中发挥重要作用［23］。CRC来源外泌体能够诱导结肠间充质干细胞（MSCs）的形态和功能改变，诱导后的MSCs具有非典型的形态并且具有更高的增殖率、迁移率和侵袭性［24］。Mulvey等［25］研究发现，用来自CRC细胞系HCT116和恶性CRC患者组织的外泌体诱导正常结肠成纤维细胞时，可诱导其产生恶性表型，同样地，用来自正常结肠成纤维细胞和正常患者组织的外泌体诱导，逆转了HCT116细胞的恶性表型。还有研究发现，来自小鼠CRC细胞系CT26的外泌体显著促进了肿瘤的生长，并降低了动物的存活率；此外，发现外泌体能够将巨噬细胞的M1表型转变为M2表型，并与肿瘤细胞的细胞因子和趋化因子相互作用，从而促进肿瘤的生长［26］。

3.2 参与肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移 Wang等［27］研究发现，源自高度肝转移性CRC细胞系HT-29的外泌体可通过招募表达趋化因子受体4（CXCR4）的基质细胞来促成转移性微环境，进而促进CRC的肝转移。Senfter等［28］研究发现，CRC细胞系CCL227分泌的外泌体含有miR-200家族成员，可转移至邻近的淋巴内皮细胞中，抑制调控EMT的转录因子ZEB1和SLUG的表达，外泌体中miR-200c的缺失可能导致邻近内皮细胞产生侵袭、迁移能力。此外，缺氧状态下的CRC细胞释放的外泌体能够通过富集Wnt4来增加内皮细胞中的β-连环蛋白核转运来促进内皮细胞的增殖和迁移，在动物体内研究也证实CRC细胞分泌的外泌体能促进肿瘤生长以及加快血管生成［29］。由CRC细胞Caco-2分泌的外泌体含有Wnt5b蛋白，能够刺激A549细胞中的Wnt5b信号传导，促进A549细胞的迁移和增殖［30］。在CRC患者中，APC（腺瘤性结肠息肉病）肿瘤抑制基因的突变很常见，并且与Wnt信号传导失调有关，当SW480中稳定表达野生型APC时，细胞表现出减弱的Wnt信号传导，并降低致瘤性；蛋白质组分析表明SW480 APC细胞分泌的外泌体特异性表达Wnt拮抗剂DKK4，这可能是调控Wnt信号通路在CRC发展过程中丢失的机制［31］。

值得注意的是，不管是在体外或体内的研究已经表明，CRC细胞的外泌体能通过肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）和Fas配体（FasL）诱导T细胞凋亡，这有助于肿瘤细胞逃避免疫系统的“监视”［32］。

4 小结与展望

癌细胞分泌的外泌体可被靶细胞摄取，在细胞间信号传导中发挥重要作用，促进肿瘤增殖、侵袭和转移等。作为细胞间通讯载体的外泌体可作为CRC诊断和预后的有效生物标志物。从非侵入性液体活组织中分离的CRC外泌体的核酸和其他成分可以作为CRC早期诊断和预后监测的有效指标。CRC来源外泌体也具有潜在的临床实用性，其可作为携带RNA、蛋白质和药物并作用于靶细胞的载体。外泌体分泌后可以将其携带的内容物传递至相邻或远处的细胞，并且可以调节受体细胞中的基因表达、信号传导或整体功能。抑制肿瘤外泌体的的释放，可作为干扰肿瘤的生物学进展以及减少耐药性产生的一种治疗癌症方法。在大多数的研究中，外泌体是从体外培养物中提取的，并且使用的浓度与生理条件有所差别。体外模型提供了有效的工具来实现快速和有价值的实验结果。然而，为了加深对CRC来源外泌体的认识及其临床意义，需要更多的体内研究来评估CRC来源外泌体在肿瘤增殖、宿主免疫调控、血管生成和对治疗的反应以及其他方面的作用。