大气颗粒物呼吸系统毒性效应机制

2018-03-18赵云利赵宇欣何义胜王元

沈阳医学院学报 2018年4期

赵云利，赵宇欣，何义胜，王元

（蚌埠医学院公共卫生学院，安徽蚌埠 233030）

环境污染，已成为影响人类健康的重大环境问题，引起了世界的广泛关注。颗粒物是大气污染的主要成分，也是环境污染危害人类健康的重要原因。流行病学调查和毒理学实验均证实大气颗粒物可以带来诸如心血管疾病、呼吸系统疾病等多种健康危害，尤其是与哮喘、肺炎、呼吸道炎症等呼吸系统疾病的发生高度相关。本文将大气颗粒物对呼吸系统产生危害的生理生化与分子机制进行了综述。

1 氧化应激

氧化损伤通常被认为是颗粒物毒性效应的首要原因。当呼吸系统遭受颗粒物的刺激时，呼吸道上皮细胞产生活性氧，细胞内氧化-抗氧化体系失衡，对细胞溶酶体、线粒体等细胞器产生损伤，导致细胞的生理生化及代谢功能障碍，最终导致呼吸系统疾病的产生或加重［1-3］。颗粒物致机体氧化-抗氧化体系失衡包含以下3个主要原因：颗粒物上附着的化学成分使得颗粒物本身具有自由基活性，如冬季燃烧颗粒物中的左旋葡聚糖、半乳聚糖和钾等成分与其氧化能力紧密相关［4］；颗粒物的刺激致使肺泡上皮细胞产生活性氧，诱导线粒体电子传递链复合物Ⅲ产生活性氧［1］；超氧化物歧化酶 SOD1、SOD2、过氧化氢酶（CAT）、过氧化还原酶6（PRDX6）等抗氧化酶活性改变［2］，细胞凋亡信号调节激酶1（ASK1）及c-Jun氨基末端激酶（JNK）信号通路被激活［1］，机体抗氧化能力及氧化防御功能降低。

颗粒物暴露可以使人肺上皮细胞A549的SOD和CAT活性发生改变［5］，燃烧颗粒物可使大鼠抗氧化酶（SOD1、SOD2、CAT、PRDX6）和核转录因子Nrf2的活性明显上升［2］。PM2.5诱导产生的活性氧可能作为信号分子，通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）激活氧化应激的关键信号通路Nrf2来防御氧化应激损伤［6］。PM2.5暴露促使Nrf2从细胞质向核内转移，诱导AKT磷酸化和NAD（P）H：醌氧化还原酶（NQO-1）、血红素加氧酶1（HO-1）、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）的转录表达［6］。但PI3K抑制剂可以显著下调PM2.5诱导的Nrf2核质转移及HO-1的转录水平［6］。颗粒物可诱导肺泡上皮细胞线粒体电子传递链复合物Ⅲ产生活性氧，激活ASK1及JNK信号通路，增加肺泡-毛细血管屏障的通透性［1］。Song等［7］研究发现，miRNA Let-7水平的显著下调及其靶基因精氨酸酶2（ARG2）的表达上调是支气管上皮细胞在PM2.5暴露后诱导的氧化损伤和细胞凋亡的内在分子机制。

2 炎症反应

颗粒物对呼吸道上皮细胞的炎症刺激反应可能是氧化应激引发的后续级联反应［8］。颗粒物暴露可促进肺泡及支气管上皮细胞分泌白细胞介素 IL-6、IL-8、IL-Iβ 和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子和细胞因子［9-11］，上调免疫活性因子NF-κB［12］，促进炎症细胞浸润从而对呼吸系统产生危害。这些炎症因子与胞外基质共同调节着颗粒物导致的组织修复和炎症反应［13］。

气管滴注颗粒物后大鼠肺组织出现炎症细胞浸润和充血，支气管肺泡灌洗液中炎症细胞数量增加；TNF-α、IL-1、IL-1β和细胞间黏附分子1（ICAM-1）等炎症介质显著上调，SOD和丙二醛（MDA）含量增加，同时诱导型一氧化氮合酶（NOS2A）、一氧化氮、细胞色素氧化酶、谷胱甘肽S-转移酶等活性物质的含量也明显上升［9-11］。松木粉尘暴露还可引起大鼠肺泡灌洗液嗜酸性粒细胞、T淋巴细胞以及肥大细胞增多［14］。在气管滴注颗粒物的小鼠中也发现了类似结果：博来霉素诱导的肺纤维化小鼠暴露于PM2.5中可导致肺组织炎性细胞浸润程度明显加重，肺泡间隔变宽，肺纤维化明显加重，肺泡灌洗液中IL-6和TNF-α水平显著增高［15］；PM2.5暴露还可导致肺气道黏膜嗜酸性粒细胞诱导性增强，支气管上皮杯状细胞增生，嗜酸性粒细胞相关细胞因子增加，支气管肺泡灌洗液中趋化因子增加，F4/80（+）CD11b（+）细胞增加，且CD206阳性的F4/80（+）CD11b（+）细胞（M2巨噬细胞）比例增加［16］。Ramanathan 等［17］在 PM2.5暴露的小鼠鼻腔灌洗液中观察到血清白蛋白含量显著增加，黏附分子Claudin-1和上皮钙黏蛋白的表达下降，嗜酸细胞性炎症因子IL-13和Eotaxin-1的表达上调，嗜酸性粒细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的明显积聚。颗粒物暴露可显著增加小鼠巨噬细胞和支气管上皮细胞中炎症因子（IL-1β、IL-8、TGF-β和环氧合酶-2）和氧化应激基因（HO-1）的表达水平［18-19］，还可激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径和转录因子NF-κB信号通路诱导炎症反应［12］。

3 免疫反应

颗粒物可对中性粒细胞产生刺激作用，提高机体特异性抗体水平，诱发哮喘等呼吸系统疾病。研究显示，柴油废气颗粒物可降低肺巨噬细胞的存活率，使机体免疫应答水平降低［20］。颗粒物还可以导致机体内CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞及自然杀伤（NK）细胞减少，CD4/CD8比例下降，机体抵抗能力降低［21］。长期PM2.5暴露能引起小鼠辅助性T细胞17（Th17）/调节性T细胞（Treg细胞）及相关细胞因子失衡，免疫功能下降［22］。PM2.5还可激活CB17-SCID荷瘤小鼠肺泡巨噬细胞清除的功能，刺激呼吸系统分泌机体蛋白［23］。

Toll样受体（TLR）能识别外源化学物，启动天然免疫，在抗感染中发挥重要作用。大气颗粒物可以激活TLR2和TLR4信号传导途径，并作为NOD样受体家族炎性小体（NLRP3）的有效激活剂促进炎症反应的发生［24］。Fuertes等［25］通过出生队列研究分析揭示PM2.5浓度与过敏性鼻炎显著相关，携带TLR4 rs1927911等位基因的儿童患过敏性鼻炎的风险增加。暴露于PM2.5的小鼠肺泡灌洗液中TLR4和TLR2的表达下调，NF-κB被激活，Th1/Th2偏移，进而驱动Th2型免疫应答，导致炎症浸润的产生［26-27］。

4 细胞钙稳态失衡

颗粒物诱导产生的自由基和炎症反应可以导致细胞脂质过氧化及胞内Ca2+浓度的增加，而Ca2+浓度的增加又导致更多活性氧的产生，加重机体的氧化应激。颗粒物暴露大鼠肺泡灌洗液中碱性磷酸酶、表面活性物质和上皮标志酶活性增加，细胞膜通透性增加以致Ca2+内流、细胞内Ca2+浓度增加［28］。支气管上皮细胞的 Ca2+信号可被大气颗粒物所介导，Ca2+通路抑制剂则可以减弱颗粒物诱导的Ca2+应答［10］。对人肺成纤维细胞的研究也证实，颗粒物可通过磷脂酶阻断剂、瞬时受体电位（transient receptor potential，TRP）M亚家族成员TRPM2抑制剂等调节细胞膜通透性，改变细胞内Ca2+信号传导［29］。因此，当给予细胞TRPM2阻滞剂克霉唑（CLZ）与邻氨基苯甲酸（ACA）时，颗粒物所致细胞氧化应激水平下降，细胞内Ca2+信号衰减［29］。细胞局部Ca2+浓度的增加，还可使细胞内钙调神经磷酸酶-活化T淋巴细胞核因子基因表达上调，诱发细胞免疫下降与凋亡［30］。

5 遗传损伤

颗粒物可导致肺泡或支气管上皮细胞发生DNA损伤，干扰肺组织细胞的核酸修复反应，引起遗传毒性和细胞凋亡，诱导呼吸系统疾病发生或加重。研究发现颗粒物通过直接作用于修复蛋白抑制DNA修复、降低DNA复制的保真度，提高DNA复制错误几率和突变率［31］，使线粒体DNA拷贝数降低［3］，基因组DNA链断裂［32］，微核增加［33］等途径引起DNA表达、修复紊乱，最终导致遗传损伤。彗星实验分析显示颗粒物上粘附的多环芳烃（PAH）和羟基类还可以使V79和人淋巴细胞产生移码突变［34］。Mukherjee等［35］发现长期暴露于烹饪烟雾可以减少家庭主妇呼吸道上皮细胞的DNA错配修复蛋白（MMR）同源物mutL1（MLH1）和 mutS 2（MSH2）的表达，增加了DNA错配的可能。

除直接对DNA产生损伤外，颗粒物吸附的物质还可以与DNA结合形成加合物，干扰DNA的正常功能。Rossner等［36］用P32标记的方法对外周血淋巴细胞DNA加合物进行检测，结果提示空气重污染地区颗粒物暴露人群的外周血苯并［a］芘（B［a］P）样DNA加合物的水平均明显升高。工业区大气颗粒物可以引起肺泡巨噬细胞产生DNA加合物从而诱导肺癌的产生［37］。柴油机颗粒排放物上吸附的B［a］P和5-甲基青烯（5-MeCHR）等多环芳烃（PAH）能与DNA的亲核位点鸟嘌呤外环氨基酸以共价键结合形成PAH-DNA加合物，引起DNA损伤［38］。

6 自噬

颗粒物可以被人支气管上皮细胞所吞噬，被吞噬的颗粒形成自噬内含体进而形成自噬体，诱导自噬的发生。研究发现，随着颗粒物暴露浓度的增加和时间的延长，A549细胞微管蛋白轻链LC3的含量逐渐上升，表明颗粒物可诱导自噬的发生，并且自噬相关基因Atg5和Beclin1的表达明显上调［5］。Xu 等［39］发现在人支气管上皮细胞BEAS-2B中，PM2.5暴露可以激活肿瘤蛋白P53，上调其下游靶基因DNA损伤自噬调节因子1（DRAM1）的表达进而诱导自噬的发生，进而激活支气管上皮细胞中的Src-STAT3通路介导VEGFA上调；此外，PM2.5暴露还可诱导丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶ATR-CHEK1/CHK1（检测点激酶1）轴的激活，进一步引发P53依赖性自噬。自噬在颗粒物诱导的炎症和黏液过度生成中发挥关键作用，沉默小鼠自噬相关基因Becn1或Lc3b可以降低颗粒物暴露导致的气管分泌物的过度产生及炎症的发生；而溶酶体抑制对自噬流的干扰可导致自噬体与自噬内含体的积累，并加剧IL-8的产生，减弱气道黏液蛋白（MUC5AC）的表达［40］。

7 表观遗传学改变

颗粒物暴露还可以导致甲基化、磷酸化、乙酰化等表观遗传学修饰，调节基因表达，影响呼吸系统疾病。颗粒物水平与慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者NOS2A的DNA甲基化水平和呼吸道炎症水平相关［41］。呼出气一氧化氮（FeNO）是气道炎症生物标志物，由气道细胞产生，其浓度与炎症细胞数目高度相关；FeNO水平又与NOS2A基因的甲基化水平密切相关［41］。De Prins等［42］以5-甲基-2'-脱氧胞苷的比例衡量人体全血DNA甲基化水平，研究结果提示成人DNA甲基化水平降低与环境PM2.5暴露水平相关。颗粒物暴露还可促进人支气管上皮细胞中PI3K家族成员中的ATM、CHK2、组蛋白2A变异体（H2AX）磷酸化，导致DNA损伤，使端粒酶活性和miR-21表达上调，芳烃受体（AhR）调节基因（CYP1A1、CYP1B1、AhRR）的表达增加［32，43］。

组蛋白3第27位赖氨酸乙酰化（H3K27ac）是参与免疫细胞活化的标记基因，H3K27ac的乙酰化水平与空气污染引起的免疫和炎症反应相关，Liu等［44］通过染色质免疫共沉淀与二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术研究发现，颗粒物暴露可以导致H3K27ac的乙酰化状态发生变化。组蛋白去乙酰化酶3（HDAC3）是基因转录调控的重要调节因子，为炎症调节相关信号所必需，PM2.5通过激活TGF-β/Smad信号通路诱导WT小鼠的肺功能损伤与炎症反应；HDAC3缺陷可促进PM2.5诱导的TGF-β/Smad信号通路的激活［27］。

8 基因表达调控

颗粒物暴露可以改变促炎症反应过程、氧化应激反应以及癌症和发育途径中相关基因的表达，共同应对来自外界的刺激。转录因子AP-1是细胞内由c-Fos和c-Jun组成的异二聚体，通过调节基因的表达来应对多种刺激，气管滴注高浓度颗粒物，大鼠肺组织c-fos和c-jun的表达显著增高［9］，AP-1 的活性增强［40］。Libalova 等［45］对PM2.5暴露的A549细胞的基因表达分析结果显示，PM2.5暴露可导致促炎症反应过程、氧化应激反应以及癌症和发育途径中TGF-β和Wnt信号通路等相关基因的表达紊乱，但涉及细胞周期阻滞、DNA修复或细胞凋亡相关的基因表达则没有发现异常。通过人胚肺成纤维细胞基因芯片分析显示ABC转运蛋白（参与外源性和内源性代谢物跨膜转移和DNA修复），Wnt和TGF-β信号传导途径（特别与肿瘤促进和进展相关），类固醇激素生物合成（参与化学物质的内分泌干扰活性）和甘油脂代谢（包括脂质与脂质信号分子的甘油骨架的脂质途径）相关基因表达明显失调［46］。