实时荧光定量PCR技术的应用及研究进展
2018-03-18郑志强
李 萌,李 雪,郑志强
(河北农业大学,河北 保定 071000)
实时荧光定量简称PCR。该技术以PCR技术为基础进行改进得到的更加快速、灵敏、特异的核算定量技术,有着光谱高敏感性以及定量精确等特点,可以对PCR中荧光信号变化进行直接探测,从而得到定量结果。为进一步加强对该技术研究及应用,本文将针对其原理、特点及应用前景进行探讨。
1 原理
Ct是荧光定量PCR技术中重要的一个值,代表着每个反应管内荧光信号在达到设定阈值过程中所需要经历循环数。在进行荧光定量PCR反应中需要加入特定波长的荧光染料或者基团,然后通过仪器对荧光物质进行监测,得到其积累信号即为PCR反应进程,从而定量定性分析起始模板。PCR反应产物随着PCR反应的进行而不断积累,同时荧光信号强度也会不断呈正比增加。荧光强度信号随着每个循环的完成而不断收集,从而通过荧光强度变化对产物量的变化进行监测,进而将结果绘制成扩增曲线图。
2 实时荧光定量PCR的检测方法
SYBR Green I检测。SYBR Green I是一种燃料,具有绿色激发波长,能够和dsDNA小沟部位相结合,不过期绿色激发波长只有在和dsDNA结合后方可发光。变性过程中DNA的双链分开,此时荧光不会发生;复性和延伸过程中会形成dsDNA此时SYBR Green I会与之结合并有绿色荧光出现。因此,扩增产物的数量可以根据荧光强度反应出来。
TaqMan探针。常规TaqMan探针的5'端对荧光发射基团FAM(6-羧基荧光素)进行标记,3'端对荧光淬灭基团TAMRA(6-羧基四甲基若丹明)进行标记。在PCR过程中,该探针无法实现延伸。按照FRET原理可知,如果保持完整的探针那么5'端发射基团的荧光发射会受到3'端淬灭基团的抑制作用。探针和模板在PCR的退火期会出现特异性杂交,在Taq酶作用下延伸期引物会沿DNA模板不断延伸直到抵达探针处,此时Taq酶的5'-3'外切活性会发挥出来,从而置换过程初选。在将探针切断后,会导致FAM和TAMRA出现分离同时将释放荧光信号。此时光密度会增加,通过荧光探测系统能够检测到这一现象。每复制一次模板就会切断一个探针,并且释放一个荧光信号。
分子信标。Taq Man探针衍生了分子信标(Molecular beacons)。分子信标结构为发夹形状,主要是单链DNA形成,两段分别标记报告基团和淬灭基团,荧光报告基团会在发夹结构形成时靠近淬灭基团,发生FRET,构象会在热循环温度达到分子信标解链温度时出现改变,可以结合模板形成线性分子,线性分子具有延展性,能够促使FRET消失,同时荧光信号由报告基团发出。
复合探针。复合探针法是将Light Cycler和分子信标两种技术的优势充分结合应用,首先将荧光探针和淬灭探针结合,两探针分别包含5'端接荧光分子和3'端接淬灭分子,两者可以实现杂交。两种探针如果在没有模板的溶液中仍可以特异结合,淬灭探针会吸收荧光探针发出的荧光,此时荧光并不会产生在容易当中;两者在有模板的溶液中且温度较高情况下可以结合模板,从而分离两探针,此时有荧光产生。溶液中模板数量越多,荧光强度会越大,所以能够根据荧光强度定量分析PCR。
3 实时荧光定量PCR的定量方法
3.1 绝对定量法
用已知的标准曲线对未知样本的量进行推算的方法为绝对定量法。此种方法需要明确标准样品的浓度情况,然后稀释标准样品,分为几个不同梯度浓度然后进行反应测试。横坐标为标准品拷贝数的对数值,纵坐标为测得的Ct值,进而绘制出标准曲线。以标准曲线为基础,在定量分析未知样品过程中根据其Ct值能够将样起始拷贝数推算出。
3.2 相对定量法
比较标准曲线的相对定量法。在一定样本中,靶序列相对于另一参照样本量变化情况进行分析的方法为相对定量法。在采用该方法过程中,需要有参照物,所以较容易绘制定量标准曲线,只要将标准品稀释度确定便可进行对比分析。
比较Ct值的相对定量法。此方法是将待测靶基因片段和内参照基因片段同时扩增,可以在两个反应管中或者一个反应管中进行扩增反应,并且就两者的Ct值之差即ΔCt进行测量。在采用此方法过程中需要用数学公式进行相对量的计算,首先要假设每个循环产物增加一倍时PCR反应指数期得到Ct值对起始模板的量一个循环的估算和起始模板数两倍相当。这种方法的前提是靶基因和内源控制物的扩增效率基本一致,所以在应用过程中效率的偏移会对实际拷贝数估计产生一定影响,因此,为了保证目的基因和内参基因的扩增效率相等应当加强对反应体系的优化,这也是该方法应用的难点之一。
4 应 用
4.1 在兽医学上的应用
病原体的分子检测。PCR技术能够快速、准确地对病原体的DNA或者RNA序列进行定性分析,能够尽早观察整个病程中病原体的情况,由于其特性,该技术在疾病早期诊断、药物治疗效果、病情判断以及诊断遗传病过程中发挥了重要作用。有相关研究者利用TaqMan MGB探针方法对牛流行热病毒进行检测,利用该技术定量分析10~100个病毒基因组分子的范围的病毒RNA。
环境监测。微生物含量是否超标是当前水资源、居家办公环境质量报告中一项重要指标,如果没有及时有效监测微生物含量,这些物质可能威胁人体的身心健康。和传统方法相比,实时定量荧光PCR能够缩短环境监测时间,且有着较高的灵敏度。
4.2 在肿瘤方面的应用
有研究学者在1998年利用RQ-PCR重排了4例前B细胞ALL中TCR,发现其敏感性类似于斑点杂交,但是比液相杂交低。还有研究者在2004年结直肠癌淋巴结的癌胚抗原(CEA)mRNA的表达量中利用PCR技术进行了测定,测量结果可以用于癌症转移的测定。
5 展 望
当前在生物学及其他领域已经充分利用实时荧光定量PCR技术,该技术有着敏感性高、测量快速等特点。随着信息科技的不断发展,该技术也在不断进步,成为医学实验研究的一项重要方法。