寡聚脱氧核苷酸协同扶正清解方抗肝癌细胞侵袭转移作用

周晓晶，李 晶，明容美，于江波，王永彬，邢日新，孙 鹏

（1.长春中医药大学，长春 130017； 2.吉林省人民医院，长春 130021；3.吉林敖东药业股份有限公司，吉林 敦化 133700）

原发性肝癌具有高发病率、高病死率的特点[1]，肿瘤细胞的侵袭转移是其主要危险因素[2]。基于当下原发性肝癌根治率相对较低、复发率高及易转移的现状，中医中药在肿瘤的防治中已凸显成效[3-4]。根据“扶正兼祛邪”的原则，扶正清解方具有益气养阴、消痈散结及抗肿瘤多种功效，临床上被用于消化系统肿瘤的辅助治疗[5-8]。本研究基于扶正清解方中各组分的不同抗肿瘤作用和自主设计的寡聚脱氧核苷酸（Oligodeoxynucleotide ODN）的诱导天然免疫、协同抗肿瘤作用[9-12]，旨在利用ODN诱导的天然免疫[13-15]和扶正清解方的多靶点作用相互协调，从而达到抑制肝癌细胞转移的目的，为临床治空治肝癌的转移提供思路和理论依据。

1 实验材料

实验药品：扶正清解方，成分：黄芪30 g，女贞子15 g，夏枯草15 g，白花蛇舌草30 g，灵芝30 g，淮山药15 g。购自长春同仁堂药店，药物质量符合中华人民共和国药典标准。以上药物在水中浸泡30 min，水提，合并滤液，抽真空过滤，旋转蒸发仪浓缩后转移至蒸发皿，于蒸发皿上挥干，于真空干燥箱进行干燥。加入IMDM培养液配成（生药含量2.66 g/mL），于- 20 ℃冰箱保存备用；ODN，由上海生物工程公司合成，溶解稀释保存于-20 ℃冰箱备用。细胞：人肝癌细胞HepG2细胞株液氮冷冻储存，为悬浮生长，使用10% FBS IMDM 培养于5% CO2，37 ℃培养箱中。

2 实验方法

2.1 MTT法检测HepG2细胞增殖 用胰蛋白酶消化对数生长期的HepG2细胞，用10% FBS IMDM制备成单细胞悬液，接种于96孔培养板中（4×104个/mL），于CO2培养箱中，37 ℃培养过夜。设置各组，37 ℃培养 12、24、36、48、60、72 h。在检测前4 h加入 MTT溶液（5 mg/mL，20 μL/孔），4 h 后吸弃上清液， 且每孔加入 150 μL 二甲亚砜溶解沉淀，振荡 10 min，用酶标仪在 570 nm 波长处测吸光度（OD 值）。计算细胞生长抑制率。抑制率=（1 －给药组 OD 值/对照组OD 值）×100%。以培养时间为横轴，抑制率值为纵轴绘制细胞增殖抑制时效关系曲线。

2.2 划痕实验检测HepG2细胞迁移能力 用胰蛋白酶消化对数生长期的HepG2细胞，用10% FBS IMDM制备成单细胞悬液，接种于6孔板（1×106个细胞/孔），37 ℃培养箱中培养24 h。吸掉培养液，PBS进行2次洗涤，用加样器头沿着培养板底部划“一”字形痕迹，再次用PBS洗去未贴壁细胞，然后按组加入成分不同的培养液。记录加入不同培养液0 h划痕间距，于24 h观测划痕间距。用如下公式进行计算迁移率：n h细胞迁移率= [1－边缘距离（nh）/边缘距离（0h）]×100%。[16]

2.3 Transwell小室检测HepG2细胞侵袭转移能力 在transwell上室涂1 mg/mL的Matrigel凝胶，37 ℃温育30 min。取用低血清IMDM培养液培养12 h的HepG2细胞，调整细胞数至1×106/mL，取100 μL细胞接种于transwell上室，对照组加入等体积无血清IMDM培养液；transwell下室加入含15% FBS的IMDM培养液600 μL， 37℃、5% CO2 培养 24 h，然后吸去上室的培养液，利用100%甲醇固定细胞20 min，吸去甲醇，PBS清洗2次。然后避光，用Giemsa染色15 min，将Giemsa吸去，PBS洗涤2次，用棉签抹去滤膜上层未穿过膜的细胞并风干，在光镜下记录膜背面细胞数，在膜上下左右中5个不同视野（×40）取平均值，按如下公式计算各组HepG2细胞的侵袭率。侵袭抑制率=（1 －加药组平均侵袭细胞数/对照组数平均侵袭细胞数）×100%。[17]

3 结果

3.1 ODN协同扶正清解方对HepG2细胞增殖的抑制作用 MTT 实验表明：ODN +扶正清解方组的HepG2细胞的生长在第24 h开始受到抑制，其细胞增值能力明显低于对Medium组及单独ODN组（P＜0.05），见图1（见插页四）。说明ODN可协同扶正清解方抑制HepG2细胞生长。

3.2 ODN协同扶正清解方对HepG2细胞迁移的抑制作用 迁移实验提示，ODN+扶正清解方组的肝癌细胞与对照组相比，更少的细胞发生了迁移（P＜0.05），见图 2（见插页四）。说明ODN可协同扶正清解方抑制HepG2细胞迁移。

3.3 ODN协同扶正清解方对HepG2细胞侵袭的抑制作用 Transwel实验显示，ODN+扶正清解方组HepG2细胞加入Transwel上室以后24 h，穿过Matrigel 胶的细胞数目显著低于对照组（P＜0.05），见图3（见插页四）。说明ODN可协同扶正清解方抑制HepG2细胞侵袭。

4 结语

肝癌细胞的高转移侵袭性是肝癌高危性的重要原因，临床研究表明，中医药在防止肿瘤的复发与转移、提高患者的免疫系统功能、抑制肿瘤生长及肿瘤血管的生成、延缓患者的生命和提高生活质量等方面发挥着重要作用。扶正清解是由扶正抑瘤方和解毒消癃饮派生出来的[18]。扶正抑瘤方由黄芪、女贞子、灵芝、淮山药组成。解毒消瘸饮由白花蛇舌草、夏枯草、山慈菇和苦参组成。方中黄芪、女贞子具有益气养阴作用，为君药；配以灵芝、山药，取其扶正培本之功，为臣药，夏枯草、白花蛇舌草具有苦寒，具有清热解毒、消痈散结作用，为佐使药[19]。研究发现，方中的各味药在消化系统肿瘤中均可起到不同的作用。而且前期研究发现自主设计的ODN具有活化天然免疫作用，能够辅佐乙肝表面抗原抑制对小鼠肝癌具有明显抑制作用[20]。本研究在扶正清解方的基础上辅以自主设计的ODN，研究其对肝癌细胞侵袭转移能力的影响。结果发现ODN可协助扶正清解方抑制人肝癌细胞HepG2的增殖，侵袭和转移。说明两者联合应用可多靶点抑制肝癌细胞侵袭转移，可为肝癌侵袭转移的防治提供实验依据和研究思路。