大鼠中脘穴和胃俞穴相关神经元的分布规律

哈丽娟，崔 建，刘晓娜，李 铁*

（1.长春中医药大学，长春 130117；2.长春中医药大学附属传统诊疗医院，长春 130022）

目前，在针灸形态学方面，神经示踪技术已经成为研究穴位神经属性的重要手段之一[1-6]。其中Alexa荧光素488和594结合霍乱毒素亚单B（AF488/594-CTB）荧光双标记示踪技术以其荧光色彩鲜明、退色慢等特点近年来越来越多的被用于这一研究领域，并在研究位于肢体的穴位方面显示出良好的标记效果[7-8]。本研究将继续利用这一技术优势，以大鼠的中脘和胃俞穴为切入点，分别采用呈绿色的AF488-CTB和呈红色的AF594-CTB对其进行标记，并对标记到的感觉神经元和运动神经元的所在部位进行系统观察。通过该项研究不仅可以揭示俞募穴相关神经元在神经系统中的规律性联系，同时还可以进一步揭示位于躯干部穴位相关神经元的分布特征，从而，为针灸临床的选穴处方提供神经解剖学方面的依据。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级雄性成年Sprague Dawley（SD）大鼠5只，体质量200～250 g，由中国医学科学院动物所提供，动物许可证号： SCKX -（军）2007-004，饲养于12 h 光照/12 h黑暗的环境中，自由饮水和摄食。实验过程严格遵守中国卫生部医学实验动物使用指南。

1.2 AF488-CTB和AF594-CTB的微量注射 本研究以AF488-CTB和 AF594-CTB（Invitroger-Molecular Probes，Eugene，美国）为示踪剂。在异氟烷吸入式麻醉下，用微量注射器将0.1%的AF488-CTB和AF594-CTB溶液各4 L分别缓慢注入大鼠的中脘和左侧胃俞穴（参照《实验针灸学》[9]，大鼠中脘穴位于腹白线上，约脐上20 mm，胃俞穴位于第十二胸椎下旁开约5 mm）。深度以不刺入腹腔为限，留针1 min后缓慢出针，防止药液渗漏。苏醒后的大鼠放回饲养箱中。

1.3 灌流及取材 示踪剂注入72 h后，在10%乌拉坦（1 mL/100 g）深度麻醉下对实验大鼠进行心脏灌流。操作方法：迅速剪开胸腔，暴露心脏，经左心室将输液针管插入升主动脉，剪开右心耳，快速灌入生理盐水150 mL，随后灌入300 mL含4%多聚甲醛和0.1 mol/L磷酸缓冲液（PB, pH 7.4）的固定液，约15 min内灌流完毕。然后取出颈、胸、腰部脊髓和T5 - L3脊神经节用于观察。取出的组织放置于上述同样的固定液中再固定2～4 h，然后存放于含25%蔗糖的0.1 mol/L PB（pH 7.4）中，并放置在4 ℃冰箱里直至组织完全下沉。其中脊神经节按椎节定位，脊髓节段则按脊神经根进入脊髓的部位来判定，同时参照脊髓节段定位相关文献[10-11]。

1.4 冰冻切片的制备 用恒温箱切片机（CRYOCUT-1800，德国）将脊神经节制成20 mm厚的矢状切片并贴附在阳离子载玻片上（Thermo，Erie Scientific Company，美国），放于暗处风干。另外，用冰冻切片机（Thermo，Microm International GmbH，德国）将脊髓制成40 mm厚的横断切片或水平切片，按顺序分为6组分置于6孔培养皿内并漂浮在0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.4）中，然后再裱贴到阳离子载玻片上放于暗处风干。在风干后的神经组织切片上滴加50%的甘油，加盖盖玻片后即可直接用于观察。

1.5 观察方法 用荧光显微镜观察组织标本中被标记的神经元，其中标记的神经元在未切的脊神经节中即可以直接观察到，见图1（插页一），其细节可以在相应的切片中观察到。所有组织标本采用尼康光学图像分析仪（日本）进行观察和拍照。图片最后经Adobe Photoshop 6.0（Adobe Systems, San Jose, CA, 美国）进行处理。

2 结果

在相应的激发光下，AF488-CTB和AF594-CTB所标记到的神经元分别呈绿色和红色。其中标记的脊神经节细胞表现为圆形或椭圆形，大小不一，见图1（插页一）；标记的运动神经元胞体和树突清晰明亮，见图2（插页一）。

2.1 AF488-CTB和AF594-CTB标记的感觉神经元 被AF488-CTB和AF594-CTB标记的与中脘和胃俞穴相关的脊神经节细胞均属于初级感觉神经元。前者以T9为中心对称性分布在T6 - T13两侧的脊神经节中，后者以T12为中心主要分布在注入侧T8 - L2的脊神经节中，见图1（插页一）。以一侧脊神经节为例，共观察到了938个与中脘相关的感觉神经元（n = 5），其数量依次为T9：273＞T10：242＞T11：180＞T8：105＞T12：60＞T7：36＞T6：22＞T13：20。而在胃俞穴注入侧的脊神经节共观察到了1 378个感觉神经元（n = 5），依 次 为 T12：359＞ T13：276＞ T11：226＞ T10：174＞T9：153＞L1：101＞T8：63 ＞L2：26。其对侧的脊神经节也观察到少量的感觉神经元。只有在胃俞穴注入侧的T10 - T11脊神经节中观察到少量被AF488-CTB和AF594-CTB双重标记的感觉神经元，见图1C1（插页一）。

2.2 AF488-CTB和 AF594-CTB标记到的运动神经元

综合在脊髓横断切片和水平切片上观察到的运动神经元，其中被AF488-CTB标记的与“中脘”穴相关的运动神经元以T9为中心分布在T5 - T10的脊髓前角第Ⅸ层的后内侧部，而被AF594-CTB标记的与 “胃俞”穴相关的运动神经元以T12为中心分布在T10 -L1的脊髓前角第Ⅸ层的最前部，见图2（插页一）。同时看到少量标记的运动神经元散在分布在颈膨大节段。由于脊髓各节段之间界限不明显，运动神经元数量没有按节段分别进行计数。在选取的51张脊髓代表性横断和水平切片的左侧，分别计数到38个和61个AF488-CTB和AF594-CTB标记的运动神经元，没有观察到双标记的运动神经元。

3 讨论

近年来，CTB作为一种高敏感度双向示踪剂，已成为穴位神经属性重要研究手段之一[12-14]。并且随着AF-CTB的问世，使得神经方面的研究有了更新的进展。与传统的示踪技术相比，AF488-CTB和AF594-CTB荧光双标记示踪技术具有高敏感、色彩鲜明、荧光持久、注射后部位局限、可同步双重标记及不易受溶液中pH值影响、无需高浓度与耗费少等优势。这项技术被越来越多地用于神经科学方面的研究[15-18]。根据本研究的结果并结合笔者以前的研究成果，充分表明这一技术在针灸形态学研究方面亦具有广泛的应用前景。

从被标记感觉神经元的分布上来看，中脘和胃俞穴相关的感觉神经元均分布在多个脊神经节中，并分别集中在各自对应的脊神经节中。就中脘和胃俞穴相关感觉神经元分布最集中的脊神经节所在的节段而论，前者高于后者3个节段。另一方面，两穴相关感觉神经元在5个节段的脊神经节又存在部分重叠。由此可见，二者之间既表现了各自在节段分布上的特异性又显示出部分重叠性。鉴于存在少量的双标记神经元，说明有些感觉神经元同时向中脘和胃俞穴发出了分支投射，这可能更有助于增强两穴之间的内在联系。

从被标记运动神经元的分布上来看，中脘和胃俞穴相关的运动神经元在胸段脊髓也存在大约3个节段的差异，不仅如此，它们在脊髓前角的分布也表现出了区域性的不同。这些结果表明位于躯干部的穴位，无论是位于腹部的中脘还是位于背部的胃俞穴，其相关的神经元在神经系统中相对应的节段和区域均呈规律性分布。这种不同穴位与神经系统存在的节段和区域性联系同样也表现在位于肢体的穴位上面，所不同的是上、下肢的穴位主要对应的是颈膨大和腰膨大相关的节段和区域，而躯干部的穴位对应的更多是胸部脊髓相关的节段和区域[7-8,19]。从此种意义上讲，本研究丰富了躯干部穴位与神经系统联系的内容，为针灸临床上的选穴处方，尤其是俞募配穴，提供了神经解剖学依据。这将有助于在临床治疗中更好地利用不同穴位的特异性和互补性来发挥它们之间的协同和增效作用。

总之，通过本研究进一步证实了AF488-CTB和AF594-CTB荧光双标记技术在针灸形态学研究中的有效性，揭示了大鼠中脘和胃俞穴相关神经元在神经系统中的分布规律与特征。同时，本研究也为更好利用该项技术深入研究中脘和胃俞穴与胃在神经系统中的联系奠定了形态学基础。