溶菌酶的研究进展及应用

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(青岛大学，山东 青岛 266071)

溶菌酶(Lysozyme)又称胞壁质酶(Muramidase), 广泛存在于自然界，具有抗细菌、真菌及肿瘤等多种药理作用，具有生物相容性好对组织无刺激性、无毒性的特点，已被制作为一种性质优良杀伤病原微生物而不破坏机体的酶制剂。根据其分子结构和来源的不同分为6类：植物溶菌酶、微生物溶菌酶、噬菌体溶菌酶(主要为T4噬菌体)、C型(蛋清溶菌酶、胃溶菌酶等)、G型(鹅型溶菌酶)和I型(无脊椎动物溶菌酶)，其中C、G型和噬菌体溶菌酶最常见。溶菌酶化学性质稳定，商品化主要为蛋清溶菌酶，仅对革兰氏阳性菌有抑制作用，为此国内外一直致力于开发改良新型溶菌酶。本文就溶菌酶的作用机制、目前的改良开发及应用情况进行综述。

1 溶菌酶的作用机制

1.1抗细菌作用 溶菌酶是存在于动物体液及组织中的固有免疫因子，通过破坏细菌细胞壁激活细菌自溶蛋白，使膜通透性增大导致细菌裂解死亡，其机制如下：N-乙酰己糖胺酶水解细菌细胞壁肽聚糖的β-1,4糖苷键；酰胺酶水解细菌细胞壁内N-乙酰葡糖胺与肽桥之间的连接—N-乙酰葡糖胺-L-丙氨酸键及内肽酶水解细菌细胞壁肽桥内的肽键。蛋清溶菌酶是目前研究最为透彻的一种溶菌酶。通过X-射线衍射得到的晶体学数据，Phillips等最先提出蛋清溶菌酶催化糖苷键断裂的能力来自静电稳定的碳正离子中间体及空间位阻效应，酶的活性位点与糖结合使其变构成半椅型构象，使糖苷键容易断裂；之后Vocadlo等又发现酶结构中Glu35对于维持酶的活性至关重要，Glu35作为糖苷键的质子供体，切割底物碳氧单键，通过Asp52形成糖基酶中间体，随后Glu35与水反应形成的氢氧根攻击糖基酶中间体，水解生成产物，而酶保持不变。

蛋清溶菌酶不能直接杀伤革兰氏阴性菌，源于革兰氏阴性菌与阳性菌细胞壁中肽聚糖含量及膜结构的不同，但可通过与革兰氏阴性菌中的脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)结合，形成非竞争性抑制剂，进而减弱LPS与巨噬细胞及上皮细胞受体的相互作用，在一定程度上可以减轻组织的非特异性炎症反应。

MCR-1是已知能进行基因水平转移的第一个多粘菌素抗性基因[1]。最近发现MCR-1基因还能改变细胞外膜带电水平，从而对溶菌酶产生交叉抗性[2]。另外，有些细菌能产生溶菌酶抑制剂以对抗溶菌酶。抑制剂锚定于细胞外表面或周质空间，通过封闭溶菌酶活性位点使细菌细胞壁不受外源溶菌酶的分解。

1.2抗真菌作用 类似于水解细菌细胞壁，溶菌酶能水解真菌细胞壁几丁质的β-1,4糖苷键。此外溶菌菌酶中壳多糖酶可以分解真菌细胞壁壳多糖。β-1,3、β-1,6葡聚糖酶和甘露糖酶可分解酵母菌的细胞壁；Sowa等[3]发现溶菌酶溶壁后通过诱导真菌凋亡发挥作用，多项实验也发现溶菌酶处理过的白色念珠菌表现出明显的细胞凋亡特征：线粒体膜电位改变、磷脂酰丝氨酸暴露以及染色质固缩和DNA断裂等。Smedowski等[4]在真菌性角膜炎研究中发现：角膜炎症细胞的浸润平均密度是细菌性感染的2～3倍 ，这表明了在真菌感染时控制炎症反应，避免产生过强炎症反应的重要性。溶菌酶可抑制高迁移率族蛋白1(High mobility group box-1 protein，HMGB1)的释放和内皮细胞中白细胞的迁移，抑制TNF-α、IL-1β及MCP-1等炎症因子在人内皮细胞中的表达。Lee等[5]也证明溶菌酶减轻炎症后期反应的机制之一是抑制HMGB1信号通路，降低其表达改善预后。

在我国真菌病属于高发常见病，而抗真菌药疗效差、毒副作用大。因此亟待寻找低毒高效的新型抗真菌药物。溶菌酶性质优良具有较强的抗真菌活性，如绿豆溶菌酶等植物溶菌酶、海洋分支杆菌溶菌酶等对烟曲霉菌、茄病镰刀菌、腐皮霉菌、白色假丝酵母等均具有杀菌疗效，可以作为潜在的新型抗真菌药物[6-7]。

1.3抗病毒作用 溶菌酶抗病毒的报道相对较少。机制之一作为碱性蛋白质，在体内中性条件下可携带大量正电荷，作为阳离子蛋白与带负电荷的病毒蛋白直接作用，和DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使侵入机体的病毒失活[8]。另外，通过激活机体免疫系统，调节淋巴细胞和巨噬细胞介导的细胞毒作用杀伤病毒。因此，溶菌酶可以作为一种安全的辅助抗病毒药物使用。

1.4抗肿瘤作用 从Shumacher等发现溶菌酶可以抑制肿瘤的生长和转移，溶菌酶对肿瘤的治疗研究已有50年的历史。资料显示有些溶菌酶对大多数肿瘤细胞起作用，甚至是恶性淋巴瘤，减少肿瘤细胞密度并延长动物的存活时间[9]。常用的蛋清溶菌酶抗肿瘤效果不明显，而鲨鱼软骨溶菌酶则具有较强的抗肿瘤活性，通过直接或间接激活机体免疫系统，调节淋巴细胞和巨噬细胞介导的细胞毒作用。海洋微生物溶菌酶还具有类似于血管生成抑制因子的作用，体外实验显示可抑制血管内皮细胞的增殖与迁移，通过抑制新生血管的生成来抑制肿瘤组织的生长。此外，溶菌酶联合丝裂霉素等化疗药物还可优化化疗效果，因此可作为辅助药物，增强治疗效果，改善愈后。

研究还发现HMGB1在癌变组织中表达量增高，胞外的HMGB1可以促进肿瘤细胞的迁移，这对肿瘤细胞侵润尤为重要。将肺癌细胞注射至小鼠皮下，给予HMGB1抗体即可抑制后期肿瘤细胞的转移，HMGB1不仅在炎症后期起重要促炎作用，还可引起晚期糖基化终产物(Receptor for advanced glycation end products，RAGE)增多，RAGE与细胞粘附聚集有关，是肿瘤治疗的靶点之一[10]。而溶菌酶可以降低HMGB1表达量，可能通过抑制HMGB1-RAGE通路发挥抗肿瘤作用。

2 溶菌酶的改良开发

溶菌酶化学性质相对稳定，一般等电点在10～11左右，最适pH为在6～7之间，不同溶菌酶最适温度差别可较大。新的溶菌酶开发主要是从各种生物中发现具有较强活性、性质独特的酶系，或对现有溶菌酶进行化学修饰、吸附等以增强其生物活性，或赋予其新的性质。 介质吸附提高酶活：例如溶菌酶吸附于纳米银粒子，抗大肠杆菌活性提高了35%[11]。然而与无机纳米颗粒相比，天然大分子制备而成的有机纳米颗粒生物相容性更好。因此，Frank等 通过将溶菌酶与聚乙二醇或聚丙二醇复合生产出一种具有抗菌活性、可注射用的低免疫原性的溶菌酶复合物。Hashemi等[12]发现溶菌酶和阿拉伯树胶交联使用可以增强溶菌酶的广谱抗菌活性，并且产物具有低温不结晶析出、不易被微生物侵蚀、无刺激性无毒等多种优良性质，可以应用于食品保鲜防腐等领域。还有许多交联物与溶菌酶交联可增强溶菌酶活性，如黄芪胶等植物胶、EDTA-2Na等螯合剂、烷基化合物、植物精油、紫苏醛等[13-15]。

化学修饰广泛应用于改良酶的性质，赋予酶更强的活性、更稳定的性质。常见的修饰类型有乙酰化、酰胺化、酯化、琥珀酰化、磷酸化、硫醇化和糖基化等，例如：糖基化可以改变蛋白表面电荷，从而改变蛋白的亲疏水性，影响蛋白质-水互作和蛋白-蛋白互作，从而引起构象改变，影响蛋白质功能。Ladan等[16]利用美拉德反应糖基化蛋清溶菌酶，然后用棕榈酸进行脂化，发现产物具有极强的抗大肠杆菌活性。Takahashi等则将糖和脂肪酰基结合并与溶菌酶交联形成缀合物，尽管产物的杀菌活性降低了，但更加稳定并具有较强的蛋白酶抗性，变性温度增加到了74 ℃。

有一部分溶菌酶由于其所处的特殊环境，导致性质不同于一般溶菌酶，如反刍动物牛瘤胃中的胃溶菌酶，能够在富含胃酸和胃蛋白酶的环境中发挥作用，因而在低pH等情况下具有很好的应用潜力。海洋特殊的高盐、高压、低温(或高温)、低营养等环境，使海洋生物所产的溶菌酶也具有一些独特性质，如嗜低温(嗜高温)、抗氧化作用强、广谱杀菌等。分析氨基酸残基发现，嗜低温酶相比中温酶含有大量带负电荷的氨基酸残基，主要是是天冬氨酸残基，因此缺乏离子键，分子呈相对“松散”状态而具有较大可变性，使其能在低温环境下仍能维持较高的催化活性。嗜高温酶中亮氨酸、脯氨酸、谷氨酸及精氨酸含量较高。一定程度说明了蛋白质氨基酸组成与热稳定的关系，这对蛋白质工程改造替换氨基酸具有重要意义。

对一些独特性质的酶，可以利用交联有机大分子、化学修饰、蛋白酶切等手段增强酶的优良性质。开发药物关键在于发现具有生物活性的新型化合物或先导物，从动植物及微生物中发现提取新型生物活性物质，是新药研究的重要选择。利用宏基因组、功能基因筛查及测序分析找到新型溶菌酶。通过发酵与基因工程相结合，或利用动植物生物反应器如乳腺生物反应器等，较容易实现大规模生产，进而获得高效、安全的新型药物。

3 溶菌酶的应用

3.1溶菌酶在医学领域的应用 溶菌酶在人体内非特异性免疫中发挥着重要作用，具有杀菌抗炎，促进组织修复及增强免疫力等多种生物活性作用，是一种性质优良的药用酶，因而已广泛应用于医药领域，例如治疗急慢性鼻咽喉炎、口腔溃疡、水痘、带状疱疹及扁平疣等，偶有较轻的过敏反应。

对于常见的肠道微生态菌群失调引起的腹泻、肠源性内毒素血症等，及阴道微生态平衡失调、厌氧菌和加德纳菌过剩生长所引起的炎性综合征等，抗生素杀菌疗效虽好但同样会杀伤益生菌，耐药菌成为新的优势菌造成情况恶化。而溶菌酶通过杀死肠道腐败球菌，促进益生菌双歧乳酸杆菌的增殖，扶植正常菌群提升免疫力，保护微生态环境增加肠道抗感染力。

在目前的研究中，已将海洋微生物发酵得到的溶菌酶膜剂成功用于治疗细菌性阴道炎，临床疗效显著[17]。从牡蛎中提取的海洋溶菌酶，已被用于制造海妇洁膜，治疗细菌性阴道炎，无毒无刺激性，放置后对胎儿和新生儿均无影响，疗效肯定，使用方便且不易产生耐药性[17]。

3.2溶菌酶在食品工程的应用 微生物引起的腐败会导致食品质量及食用价值下降，甚至可能导致食物中毒。因此，杀灭微生物对食品质量及安全十分重要。目前常用的手段有干燥、加热、排除空气、紫外线照射、添加防腐剂等，但对各项措施副作用的担忧也越来越多。因此，溶菌酶等天然抗菌活性物质逐渐登上食品工程的舞台，一些溶菌酶具有无毒防腐、抗氧化及溶菌谱广等特点功效，与一些化学试剂配伍后还可增强活性[18]。欧盟在2000年已经允许在海产品、奶酪等乳制品、豆类产品、葡萄酒等酒类及红肠等肉类中添加溶菌酶，作为一种安全广谱的杀菌防腐剂。

Cooper等[19]发现可以使用溶菌酶治疗大肠杆菌引起的仔猪腹泻，因此可以用作饲料的防腐剂和保健添加剂。又如人乳中含有大量溶菌酶，远高于牛乳，可在动物乳制品中添加溶菌酶，使牛乳“人乳化”，有利于维持婴儿肠道微生物群正常同时还能促进婴儿肠道双歧乳酸杆菌增殖，促进乳酪蛋白凝乳利于消化。所以溶菌酶又是婴幼儿食品的良好添加剂 。海产品一般在低温下储藏，低温会限制大多数酶的使用效果。海洋生物特别是生活在极端环境下的海洋微生物能产生丰富的极端酶，具有更为独特的酶学性质，如嗜低温几乎不受金属离子等添加剂的影响等，已引起国内外研究人员的极大关注。

此外，溶菌酶还可用于分解细胞壁，制备原生质体，及用于微生物分类和育种，作为递送药物蛋白及研究蛋白质功能结构的模式蛋白等，已成为细胞工程和基因工程中不可或缺的工具酶之一[20]。近年来，随着生物技术的发展，寻找具有全新性质的酶已成为酶制剂研究的热点。据统计，人们已经从微生物中发现了10 000多种具有生物活性的代谢产物，许多具有开发前景的生物活性物质并不是由动植物产生的，而是由与其共生的微生物产生的。海洋微生物资源丰富、种类繁多，几乎包括所有微生物类型，能产生丰富的极端酶，其生物多样性远远多于陆地生物多样性。利用宏基因组手段，筛查环境中的微生物，发现具有优良性质的新型酶，利用发酵、生物反应器等手段或结合基因工程实现规模生产，获得高纯高效的酶类，例如通过生物发酵得到的海洋溶菌酶以其显著疗效已引起了极大关注。因此，溶菌酶在医药、生产科研等领域具有独特的优势和广阙的应用前景。