植物细胞器内蛋白质量控制相关机理综述

韩薛婧娉，胡盈盈，余 颖，王炫婷，徐 珂，祝妍瑾

（浙江师范大学初阳学院，浙江金华321000）

蛋白质是生物体生命活动的执行者，其结构和活性决定了功能强弱，最终影响生物体的活动。许多mRNA翻译出的多肽链不具有生理活性，需要折叠、组装成大分子蛋白质后才能在特定位点发挥其生物学功能。蛋白质翻译过程出错或蛋白质损伤是生物体内普遍发生的现象，但蛋白质受损更多情况下是由植物体内积累活性氧（ROS）的攻击引起的，叶绿体、线粒体和过氧化物酶体等细胞器均能产生ROS。叶绿体光合代谢中，O2首先在光系统Ⅰ被还原为，在超氧化物歧化酶（SOD）的歧化作用下产生H2O2，H2O2如不能被及时清除，则会在Fe2+或Cu2+作用下，反应产生羟自由基（·OH）[1]。线粒体中，电子沿着电子传递链传递给末端氧化酶之前，离开呼吸链而与氧反应生成超氧自由基的过程是线粒体产生ROS的主要来源[2]。过氧化物酶体中，膜上NADH和NADPH受驱动会产生O2-，基质中，黄嘌呤氧化酶（XOD）催化黄嘌呤转化为尿酸的反应中也会产生O2-，此外，芬顿反应（Fenton reaction）能产生·OH 和单线态氧（1O2）[3]。

植物在自然生长条件下极易受到干旱、盐、热等非生物胁迫，此时，植株内ROS的产生和清除平衡被打破，ROS大量积累[4]，由此引起植物细胞器甚至细胞的损伤和死亡，进而影响植物的正常生长发育。在农业上，严重的非生物胁迫可能导致作物生长缓慢、产量低下，影响经济效益。

为了确保蛋白质的正常折叠、组装、运输和异常蛋白的修复、降解，植物体内存在严格的蛋白质量控制系统，以维持蛋白质的动态平衡。由于细胞器在细胞中扮演着非常重要的角色，因此，细胞器内蛋白质量控制也显得尤为重要。当细胞器蛋白受到活性氧攻击而出现损伤时，植物细胞器蛋白质量控制系统主要通过修复氧化蛋白和水解无法修复的蛋白2种途径来保护自身正常生长。

1 植物细胞器蛋白氧化损伤及检测

1.1 细胞器蛋白氧化损伤方式

ROS对蛋白质的氧化损伤体现在很多方面，ROS能使蛋白质巯基氧化成二硫键（P-S-S-P）和谷胱甘肽二硫键（P-S-S-G），因此，多数催化中心为巯基的蛋白质失活。此外，氧化蛋白可能含有活性基团，因而，有机会造成其他生物分子的二次氧化损伤[5]。ROS对蛋白质的损伤机理主要有5个方面：修饰氨基酸，断裂肽链，形成交联聚合物，改变构象和产生免疫原性。

1.1.1 修饰氨基酸 不同自由基会特异性修饰氨基酸，其中，含不饱和键的氨基酸对氧化损伤特别敏感，且氨基酸被破坏的程度与自由基的摩尔浓度呈正相关[6]。·OH是化学性质最活泼的活性氧，几乎能与所有的氨基酸反应，如可氧化精氨酸（Arg）为谷氨酸（Glu）或谷氨酸半醛残基等[7]。

1.1.2 断裂肽链 自由基主要通过水解肽键和直接断裂2种方式导致肽链断裂。自由基攻击氨基酸的肽键可导致其共价键解开，以含脯氨酸（Pro）的肽链为例，ROS的攻击会导致羰基生成，进而转化为α-吡咯烷酮，α-吡咯烷酮水解后便与相邻氨基酸断开。肽链直接断裂过程为·OH在有氧参与时，带走α碳原子上的H，形成过氧基，酸性条件下，肽键转变成亚氨基肽，水解断裂[8]。

1.1.3 形成交联聚合物 多种机制均可导致蛋白质的交联聚合。如：被氧化后，酪氨酸（Tyr）形成二酪氨酸，半肽氨酸（Cys）生成二硫键，均可以使蛋白质交联聚合[9]。当蛋白质接触·OH后，生成大量双酪氨酸，且可以交联方式与Tyr和Cys数目密切相关。

1.1.4 改变构象 蛋白质氧化修饰过程常伴随肽键断裂、蛋白分子交联聚合等过程，其分子结构在热动力学上不稳定，进而改变蛋白质高级结构，蛋白质失活。研究发现，·OH可改变谷氨酞胺合成酶的高级结构[10]。

1.1.5 蛋白质免疫学性质的改变 活性氧可引起免疫反应增强，其原因可能是ROS与自身某些免疫性疾病中抗原抗体复合物的形成有关[8]。

1.2 蛋白质量检测指标

为了判断蛋白质量，比较常用的指标有羰基化蛋白质量、游离巯基含量、蛋白质分子表面疏水性、蛋白内源荧光光谱、蛋白聚集程度等。

在引起蛋白质氧化损伤的反应中，肽骨架断裂、氨基酸侧链氧化等都与新生成的蛋白质羰基有关，自由基氧化多肽成羰基这一现象比较普遍，因此，羰基含量被作为判断蛋白质氧化损伤程度的一个重要指标[11-12]。在稳定蛋白质分子构象上，二硫键和巯基发挥了非常重要的作用[13]，氧化可以改变巯基/二硫键交互反应的平衡常数，也能改变蛋白质分子中巯基和二硫键的比例及分布[14]，游离巯基含量由此可作为评价蛋白质氧化水平的指标。表面疏水性对蛋白质的理化性质和功能特性有重要影响[15]，因此，可用来衡量蛋白质变性程度，不仅反映表面疏水性基团的相对含量，还反映蛋白位点的细微变化。蛋白荧光反映蛋白质量，尤其体现在最容易被氧化的色氨酸（Ser）上，Ser残基极易被转化为亚稳态的自由基、过氧自由基、犬尿氨酸，使得内源荧光强度下降[16]。蛋白聚集程度也是体现蛋白质量的一个指标，可通过蛋白质的溶解度来进行简单表征。

2 植物细胞器氧化蛋白修复

合适的生理环境是细胞生存和发挥功能的必要条件，在维持着体内氧化还原稳态方面，硫氧还蛋白家族有重要作用。该家族包括蛋白质谷氧还蛋白（GRX）、硫氧还蛋白（TRX）和二硫键异构酶（PDI），其中前两者更为重要[17]。由于自身氧化还原电位不同，生物体内GRX和TRX多作为还原剂，而PDI多作为氧化剂。

2.1 谷氧还蛋白系统

该系统由GRX、还原型辅酶Ⅱ（NADPH）、谷胱甘肽还原酶（GR）、谷胱甘肽（GSH）构成。电子从NADPH向GR，GSH传递，最后到GRX。谷氧还蛋白通过还原过氧化氢酶、脱氢抗坏血酸[18]等多种途径介入氧化应激过程。

GRX依赖于GSH催化巯基-二硫键的转换反应，对和GSH相连的二硫化物有高度的底物特异性。GRX催化机制可分为单巯基催化和二巯基催化2种。单巯基催化指GRX催化还原与GSH相连的二硫键，N端Cys的巯基作用于目的蛋白二硫键，生成反应中间体P-SH和GRX-S-S-G，后者的二硫键被第2个分子的GSH还原，生成GRXreduced和GSSG。二巯基催化指GRX催化还原蛋白质二硫键，GRX活性中心N端Cys的巯基作用于二硫键，生成中间产物，GRX的C端Cys的巯基攻击产物的二硫键，生成P-SH和GRXoxidized。GSH攻击后者分子内二硫键，GSH和活性中心N端Cys的巯基新生成二硫键，形成GRX-S-S-G复合物。最后，GSH攻击复合物的二硫键，生成GSSG和GRXreduced。

2.2 硫氧还蛋白系统

TRX在氧胁迫反应中作用很大，它可还原具有修复氧化蛋白功能的酶，如过氧化物酶、蛋氨酸硫氧化物还原酶等。

硫氧还蛋白系统由NADPH、硫氧还蛋白还原酶（TR）、硫氧还蛋白构成。TR可催化氧化型的TRX被还原。真核细胞中的TRX被一种依赖于NADPH的TR（NTR）还原；在色素体和蓝细菌中，TRX被依赖于FAD的TR（FTR）还原。

TRX催化反应过程主要为：活性中心N端的巯基攻击目的蛋白的二硫键，形成中间体TRX-protein，后被C端的巯基还原，生成氧化态TRX和还原态目的蛋白，TRX最后被相应的还原酶还原。

3 植物细胞器氧化蛋白清除

3.1 氧化蛋白的酶降解

受到损伤的蛋白质需要通过蛋白酶除去。蛋白酶广泛分布于生物细胞中，主要作用对象是肽键，作用包括五大类：清除错误折叠、修饰和定位的蛋白；供给氨基酸；激活酶原；调控关键酶及调节蛋白含量；除去已定位蛋白信号。在细胞质和细胞核中行使降解氧化蛋白质功能的主要是26S蛋白酶体，在细胞器中行使该功能的蛋白酶有ClpP蛋白酶、Lon蛋白酶等。

3.1.1 ClpP蛋白酶 ClpP蛋白酶广泛存在于各种生物体中，目前在拟南芥中已发现了6个ClpP蛋白异构体（ClpP1-6），其中，仅ClpP2定位于线粒体，其他均在叶绿体中。

ClpP需要与分子伴侣（如ClpA，ClpE和ClpX等）组合成复合物，才能发挥蛋白酶的作用：捕获目的蛋白，利用ATP高能磷酸键断裂产生能量将底物蛋白结构松散后转移至ClpP，将多肽水解为小的肽段后释放。此外，Clp复合物的2个亚基分离时也可发挥一定功能。

3.1.2 Lon蛋白酶 Lon蛋白酶是细胞器中蛋白质质量控制的最主要成分，高度保守，具有分子伴侣及调控蛋白质降解等功能。

拟南芥中存在4个Lon蛋白酶，分别为Lon1，Lon2，Lon3和Lon4蛋白酶。其中，Lon1和Lon4蛋白酶既定位于线粒体中，又定位于叶绿体中，参与线粒体功能的维护以及ABA信号途径中的蛋白降解、叶绿体自愿响应和帮助抵御干旱胁迫；Lon2定位于过氧化物酶体中，研究表明，Lon2蛋白酶可有效清除过氧化物酶体中的氧化蛋白质，且可能还具有调控过氧化物酶体中抗氧化酶酶活的能力；Lon3为假基因，是Lon基因家族成员中唯一具有潜在核定位信号的基因。

3.2 自体吞噬空泡对氧化蛋白的清除

除酶降解外，植物细胞器氧化蛋白清除还有一个重要途径是细胞自噬，该途径对氧化蛋白具有较高的清除效率。自体吞噬是指细胞质的成分在液泡或溶酶体中被降解的过程，其分子机制在高等真核生物中保守性较高。自体吞噬包含微型和巨型2种主要形式。微型自体吞噬指细胞质的成分被胞吞进入细胞器，即溶酶体或者液泡内膜直接包裹底物并降解。巨型自体吞噬则是胞质成分先由双层膜结构包围，形成自吞噬体，之后其外膜与溶酶体、液泡膜融合，通过胞吞方式进入溶酶体或液泡中，最终将其降解。

4 总结与展望

植物细胞器在受到胁迫时将产生大量活性氧，不仅损伤细胞器自身，活性氧还可通过自由扩散进入细胞内，对细胞其他部位产生影响。蛋白质是极易受氧化损伤的生物大分子，其损伤将严重影响细胞器甚至细胞的正常生命活动。目前，植物细胞器中已经发现了多种蛋白质量控制方式。但由于蛋白质量控制的复杂性，许多具体机制仍处于研究探索阶段，尚不完整。此外，细胞器水平的蛋白质量控制与细胞水平的蛋白修复和清除机制之间的内在联系也尚未研究清楚。这些相关机制的深入探究和完善将为农作物育种等方面的研究提供理论参考。