高效脱氨氮菌的分离纯化及降解条件的响应面法优化

宦臣臣， 梁引库， 闫志英

(1.陕西理工大学 陕西省资源生物重点实验室， 陕西 汉中 723000； 2. 陕西理工大学 生物科学与工程学院， 陕西 汉中 723000; 3.中国科学院 环境与应用微生物重点实验室， 成都 610041)

随着规模化养殖业的迅猛发展，畜禽粪便、污水排放不断增加，使得我国许多自然水体中的氨氮远超出自然环境所能承受的范围[1]。过量的氨氮造成包括主要湖泊河流在内的各类自然水体的富营养化现象十分严重，直接导致水体的自净功能下降，BOD和COD等数据超标，带来严重的生态环境污染问题[2]。目前，微生物菌剂脱除氨氮以其经济、简便、高效的优势，正在成为水体脱氮的主力[3]。但现有的菌剂氨氮去除率低，仅为50%～80%，存在脱氨氮效果不理想等问题[4-6]。寻求新的高效的脱氨氮菌株已然成为目前亟待解决的问题之一。

响应面分析法是20世纪中后发展起来的优化试验条件方法[7]。该方法采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的关系，对影响产量的各因子水平及其交互作用进行优化评价，并求出最佳值[8]。由于其能用较少的实验数据推算出目标值的优化条件，优化效率高，在微生物方面得到了广泛的应用[9]。

1 材料与方法

1.1 菌株的分离及鉴定

样品采自四川某污水处理厂二沉池活性污泥与实验室的堆肥样品，将采集的活性污泥与堆肥样品在好氧条件下用含氨化合物的富集培养基进行驯化，富集4次，每次5天，20 d后对富集样品进行梯度稀释，从10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7，10-8稀释度下吸取0.25 mL于分离培养基平板涂布，30℃恒温培养，进行多次的纯化分离，挑选出形成的单菌落进行异样硝化能力测试[10]。筛选出具有较好的异养硝化特性的菌株至于甘油，冷冻保存。

生态学鉴定：对菌体进行革兰氏染色，在光学显微镜下观察染色结果并拍照；以及通过扫描电子显微镜拍摄照片来观察菌株DFN2的形态。

分子生物学鉴定：使用细菌基因组DNA提取试剂盒，提取菌株的基因组DNA，以此为模板，利用16SrDNA基因通用引物，进行PCR扩增。扩增16SrDNA的引物：FprimerF27 ：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’和R-primerR1492 ：5’-GGC TAC CTT GTT ACG ACT T-3’。对扩增好的PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳分离检测PCR产物，产物由成都擎科生物工程技术服务有限公司测序。测得的序列登陆NCBI网站，通过Blast 程序与Genbank中核酸数据进行比对分析，使用MEGA6.0软件绘制菌株进化发育树。

1.2 主要培养基

富集培养基(g·L-1)：(NH4)2SO42.0,琥珀酸钠13.85，乙酸钠5.0，葡萄糖5.0，维氏盐溶液50 mL,pH值7.0。维氏盐溶液配制(g·L-1)：K2HPO45.0，MgSO4·7H2O 2.5，NaCl 2.5，FeSO4·7H2O 0.05，MnSO40.05，pH值7.0。

分离培养基(g·L-1)[11]：(NH4)2SO40.47,琥珀酸钠 5.62,维氏盐溶液50 mL, pH值7.0，固体培养基添加2.0%琼脂，121℃，30 min高温灭菌处理。

牛肉膏蛋白胨培养基(g·L-1)：牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，加水至1 L，pH值7，固体培养基添加2.0%的琼脂，121℃，30 min高温灭菌处理。

1.3 菌株培养条件的优化

1.3.1 单因素实验

将菌株DFN2分别接种在不同pH值(5，6，7，8，9)的脱氮培养基中，于35℃，160 r·m-1条件下培养14 h后取样，测定其氨氮的降解率以及OD600，考察不同pH值条件下菌株对氨氮的降解影响。

将菌株DFN2接种到脱氮培养基中，分别于25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，160 r·min-1条件下培养14 h取样，测定其氨氮的降解率以及OD600，考察不同温度条件下菌株对氨氮的降解影响。

将菌株DFN2按1%，3%，5%，7%，9%的接种量接种到脱氮培养基中，于35℃，160 r·m-1条件下培养14 h后取样，测定其氨氮的降解率以及OD600，考察不同接种量条件下菌株对氨氮的降解影响。

1.3.2 响应面法实验

在单因素实验的基础上，根据BOX-Behnken 的中心组合实验设计原理，选取pH值(A)、温度(B)、接种物浓度(C)为变量，以氨氮的降解率(Y)为响应值，每个变量按低、中、高3个水平分别以-1，0，+1进行编码[12]。

实验因素及水平见表1。

表1 响应面分析因素和水平

1.4 分析方法

1.5 菌株DNF2对沼液废水的降解

在响应面优化条件下，将菌株DFN2接种到沼液废水中，测定菌株对废水中氨氮的降解情况。

2 结果与讨论

2.1 菌株的鉴定及生长曲线测定

菌株DFN2的菌落特征为圆形、表面湿润、乳白色、不透明、有光泽、边缘整齐。经革兰氏染色通过显微镜观察可知该菌为革兰氏阴性菌(见图1)；通过扫描电镜(见图2)观察到菌体为杆状，大小约为0.4 μm×(0.9～1.5)μm。

经16srDNA测序BLAST同源性检索，发现菌株DFN2与Alcaligenesfaecalissubsp.phenolicus(DSM 16503(T))的相似性在99%以上，结合菌株的形态学特征，初步确定该菌株为粪产碱杆菌亚种酚类。使用MEGA 6.0软件，以Neighbor-Joining[14]法绘制系统发育树，结果如图3所示，得到DNF2的系统进化树，进一步表明菌株DFN2为Alcaligenesfaecalissubsp.Phenolicus。

根据光密度OD600与时间的关系，采用Bioscreen C仪器测定菌株DFN2的生长曲线，如图4所示。由图可知菌株DNF2在24 h达到对数生长期，24～96 h之间为稳定期，96 h之后开始进入衰亡期。根据菌株的生长曲线，在进行菌株脱氨氮实验时，选择对数生长期和稳定期交界点(24 h)的菌液为种子液，以保持菌株的最高活性和稳定性。

图1 菌株DNF2 的革兰氏染色图

图2 菌株DFN2的扫描电镜照片

图3 菌株DFN2的系统进化树

图4 菌株DFN2生长曲线

2.2 单因素实验分析

2.2.1 pH值的影响

由图5可知，菌株DNF2能在不同pH值条件降解氨氮。在弱碱环境下(pH值8～9)对应的氨氮去除率分别为72.5%，71.06%，OD600值分别为1.018，0.969。在中性条件下(pH值为7)氨氮的去除率为78.39%，OD600值为1.025。在弱酸性条件下(pH值5～6)，氨氮去除率降至54.5%，69.8%，OD600值分别为0.85，0.94。可见菌株最佳生长条件为pH值为7时。菌株DNF2适应的pH值范围与王兆阳[15]、梁贤[11]等研究的菌株大致相同。

2.2.2 温度的影响

由图6可知，菌株DNF2可在不同的温度条件下降解氨氮。在温度为25℃时，菌体密度为0.5，去除率为46%，随着温度的升高，菌体生长量和氨氮去除率增加，特别是在温度为35℃时，氨氮的降解率达到最高，为79.2%，菌体密度为1.02。当温度过高为40℃和45℃时，菌体密度明显降低，氨氮去除率也下降，这是因为随着温度升高，生物活性物质变质，细胞功能下降甚至死亡，影响反应效果[16]。

图5 pH值对菌株DFN2的影响

图6 温度对菌株DFN2的影响

2.2.3 接种微生物浓度

如图7可知，将菌株DNF2以不同接种物量接种到脱氨培养基中，其降解效率不同。当菌体接种量为5%时，氨氮降解效率最大，高达78.9%，且菌体密度较大。其他接种条件下降解效率均低于接种量为5%时，原因可能是菌液接种量少时，营养充足，菌液与氨氮充分接触，虽然降解不完全，但降解速度快；接种量过多时，营养物不足，菌种之间相互竞争，导致降解速度相对降低。

2.3 响应面试验结果及数据分析

2.3.1 试验设计方案及结果

根据单因素实验结果，由Design-Expert 8.0.6 统计软件分析设计出的实验方案及实验结果如表2所示，以氨氮浓度降解率为响应值(Y),以pH值(A)、温度(B)、接种物浓度(C)为自变量，建立三因素三水平中心组合实验设计共包括17个实验方案，其中有5个中心实验点，用以计算实验误差。

图7 接种物浓度对菌株DFN2的影响

实验号ABC氨氮降解率 / %1-10-164.9200086.530-1135.9400091.15-1-1025.7600091.67-10152.1801126.4910-173.51000092.61101-127.31211037.0130-1-151.61400091.5151-1044.31610178.717-11015.2

2.3.2 回归方程拟合及方差分析

采用Design-Expert8.0.6 软件对所得数据进行二次回归分析，分析结果见表3，对各因素回归拟合后，得到二次回归方程如下：

Y=90.66+9.45A-6.45B-3.03C+0.80AB+4.50AC+3.70BC-14.06A2-46.06B2-9.31C2

表3 回归方程的方差分析结果

注：＊＊＊差异极显著(p<0.001)；＊＊差异高度显著(p<0.01)；＊差异显著(p<0.05)

2.3.3 响应面图分析

根据回归方程绘制氨氮降解率随各因素变化的响应面曲面图。由响应面曲面图可知pH值、温度、接种物浓度这3个因素对氨氮降解率的影响(见图8～图10).每个响应面分别代表着两个独立因素间的相互作用，另一个因素保持在编码的0水平[17]。

图8 Y=f(AB)响应面和等高线

图8结果显示，pH值和温度的交互作用不显著。在pH值一定的条件下，随着温度的增加，氨氮的降解率会迅速地升高，然后下降。在温度一定的条件下，随着pH值的增加，氨氮的降解率缓慢升高至平稳，然后下降。

图9结果显示，pH值和接种物浓度之间交互作用显著。在pH值一定的条件下，随着接种物浓度的增加，氨氮的降解率逐渐升高至平稳，然后下降。在接种物浓度一定的条件下，随着pH值的增加，氨氮的降解率缓慢升高至平稳，然后略有下降。

图9 Y=f(AC)响应面和等高线

图10结果显示，温度和接种物浓度之间交互作用显著。在温度一定的条件下，随着接种物浓度的增加，氨氮的降解率逐渐升高至平稳，然后下降。在接种物浓度一定的条件下，随着温度的增加，氨氮的降解率迅速升高至平稳，然后下降。

图8～图10直观的反映了各因素对响应值的影响，由图可知pH值和温度的交互作用不显著，pH值和接种物浓度之间交互作用显著，温度和接种物浓度之间也有显著的交互作用。并且可以得出A，B，C存在极值点，通过Design-Expert 8.0.6软件可以得到Y(氨氮降解率)最大估计值为92.54%，对应的各因素为pH值为7.63，温度为34.29℃，接种物浓度为4.6%，即为最优的氨氮降解条件。

图10 Y=f(BC)响应面和等高线

为了验证响应面分析的可靠性，采用上述最佳工艺参数进行实验验证，用脱氮菌株DFN2进行3次摇瓶实验，培养14 h后离心，取上清，采用紫外分光光度计定量测定验证。优化条件下氨氮的平均降解率为92.05%，平均氨氧化速率为与优化前的条件相比，菌株降解氨氮的能力提高了12.85%。结果表明，经过响应回归方程拟合出的理论值与实际值相吻合，证明用响应面法可以有效地优化培养条件，促使菌株降解氨氮的能力得到了很大的提升。

图11 菌株DNF2降解沼液废水

2.4 菌株DNF2降解沼液氨氮试验

根据响应面试验，在降解条件最优的条件下，将菌株DNF2接种沼液废水中，结果如图11所示，在初始氨氮浓度为416.23 mg·L-1条件下，菌株在84 h时可将氨氮降解到8.53 mg·L-1，降解率为97.95%，在96 h时，氨氮浓度为2.41 mg·L-1，降解效率为99.42%。

3 结论

(1)从堆肥和活性污泥中分离得到一株能高效降解氨氮的菌株DNF2。经鉴定为粪产碱杆菌(Alcaligenesfaecalissubsp. Phenolicus)。

(2)通过单因素实验，采用Box-Behnken设计对菌株DNF2降解氨氮条件进行优化，建立了氨氮降解回归模型，该模型优化的降解条件为：pH值为7.63，温度为34.29℃，接种物浓度为4.6%。在此条件下，通过验证试验测得氨氮的降解率可达92.05%，与优化前的条件相比，菌株降解氨氮的能力提高了12.85%，与模型预测结果相近，进一步验证了模型的可靠性。

(3)在优化条件下，将菌株DNF2接种到沼液废水中，96 h可将416.23 mg·L-1氨氮降解至2.41 mg·L-1，降解效率为99.42%。