溴化1-丁基-3-甲基咪唑离子液体在空心菜中的吸收积累特性及其毒理效应

米合拜·伊力木拉提， 马晓利，陈平，努扎艾提·艾比布

新疆师范大学化学化工学院，乌鲁木齐 830054

离子液体作为一种新型的“绿色溶剂”[1]，是一类完全由离子组成的室温熔融盐。因其具有不易挥发、导电性强、热稳定性高等特性，其逐渐代替了传统挥发性有机溶剂[2]，广泛用于化学和生物反应中。离子液体在广泛应用的同时会不可避免地被排放到环境中，带来潜在的生态风险。在2002年首届Green Solvents For Catalysis国际学术研讨会上研究者首次讨论了离子液体潜在的毒性。离子液体由咪唑鎓盐、吡啶盐、季膦盐、吡咯鎓盐、哌啶鎓盐等阳离子和卤素及无机酸根阴离子组成，它的毒性取决于阴、阳离子的类型和烷基取代基的长度[3]。研究报道，离子液体在一定程度上对微生物[4-5]、植物[6]、动物[7-8]均有毒害作用。Thamke和Kodam[9]用[C4mim]Br对孔雀鱼进行96 h急性毒性实验，发现孔雀鱼细胞膜损伤，抗氧化酶活性增加；Raquel和Carlos[10]报道[C4mim]Br抑制了藻类的生长速率；Chen等[3]和Liu等[11]接连报道咪唑类离子液体抑制小麦、水稻幼苗生长，降低了光合作用的初级反应，停止了光合电子传递过程，对植物的生长具有一定的毒性。而有关[C4mim]Br与植物相互作用的研究鲜见报道。

空心菜(IpomoeaaquaticaForsk)是一种一年生植物，其耐受性强，种植成本低，一次栽种可多次收割，可以将吸收的养分和污染物移出水体，常被用于净化污染水体[12]。国内外学者发现，空心菜能有效地吸收、降解受污染的土壤或水体中的重金属、持久性有机污染物以及抗生素类污染物[13-15]。本文基于毒理学实验，以咪唑类离子液体为研究对象，考察了离子液体对空心菜的生长和各项生理生化指标的影响，并研究了空心菜对离子液体的吸收和体内积累特性，旨在为离子液体的环境风险评价提供科学依据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验药品与仪器

1.1.1 实验药品

次氯酸钠(5%，阿拉丁试剂有限公司)，溴化1-丁基-3-甲基咪唑(99.0%，上海成捷化学有限公司)，硫代巴比妥酸(98.0%，天津市北联精细化学品开发有限公司)，氯化三苯基四氮唑(98.0%，上海蓝季科技发展有限公司)，甲酸(88%，国药集团化学试剂有限公司)，甲醇(色谱纯，美国西格玛奥德里奇有限公司)。

1.1.2 实验仪器

C18分离柱(Agilent Zero Bax SB-C18，2.1 mm×50 mm，1.8 μm，美国安捷伦科技有限公司)，高效液相色谱(Agilent 1260，美国安捷伦科技有限公司)，康氏振荡器(KS型，无锡建仪实验器材有限公司)，离心机(RG-160AT，上海卢湘仪离心机仪器有限公司)，旋转蒸发器(YRE-52C，巩义市予华仪器有限责任公司)，高效液相色谱(Agilent 1290，美国安捷伦科技有限公司)-三重四级杆串联质谱(Agilent 6460，美国安捷伦科技有限公司)。

1.2 测定方法

1.2.1 培养方法

供试空心菜品种为竹叶空心菜，种子购于新疆农业科学院，将种子先用5%的次氯酸钠溶液进行消毒，再在蒸馏水中浸泡12 h后有序地放入含有无菌吸水纸的托盘中，待催芽育苗培养至8 cm高左右时移到150 mL锡箔纸包裹过的三角瓶中，每瓶一株，用1/2霍格兰营养液适应性培养2周后，选取长势一致的空心菜将营养液换成分别含0、0.5、1、2、5 mg·L-1[C4mim]Br的全浓度营养液，以5 mg·L-1无植物培养为光降解对照，再以不添加[C4mim]Br (0 mg·L-1)空白植物组作空白对照，并用记号笔标记锥形瓶液位线。每个实验条件设置3个平行，培养过程中保持连续通气，光暗比为16 h : 8 h，光照强度2 100～2 500 lux，环境温度为(26±1) ℃。

1.2.2 毒理学实验

实验开始时分别测量每株空心菜的根长、株高以及鲜重，之后每隔3天重复测量一次，用该天测量值减去初始值，求得空心菜生长变化量。用Logistic模型对抑制率-浓度之间的关系进行拟合并计算相应的EC50值。用分光光度法测定叶绿素的含量，单位mg·g-1；用硫代巴比妥酸(TBA)法测定丙二醛含量，单位nmol·g-1；用氯化三苯基四氮唑(TTC)法测定根系活力[16]，单位mg·g-1·h-1。

1.2.3 [C4mim]Br吸收实验

实验过程中，第0、3、6、9、12天用玻璃棒搅匀取0.5 mL水样，过膜，4 ℃保存。用配备C18分离柱的高效液相色谱测定[C4mim]Br的含量。每天观察锥形瓶液位线的变化，根据实验前标记好的高度向锥形瓶用滴管加入一定量的蒸馏水至标记处，以补偿蒸发带来的水消耗。

1.2.4 空心菜体内[C4mim]Br的提取

分别剪去等量鲜重(0.5 g)的空心菜根部和地上部分新鲜样品，在液氮条件下用陶瓷研钵将样品碾碎成粉末。将粉末状植物样品与8 mL萃取液(0.5%甲酸∶水∶甲醇=1∶1∶1)混匀，剧烈震荡10 min后置于振荡器摇动24 h，离心收集上清液，旋转蒸发至2 mL左右，再用氮气吹至干燥，最后溶解于1 mL的甲醇，过0.22 μm的滤膜得滤液，采用高效液相色谱-三重四级杆串联质谱对萃取液中的[C4mim]Br定量分析。

1.3 数据计算分析

植物富集系数(enrichment coefficients, EC)与转运系数(translocation factor, TF)，能直观地表征植物对污染物的吸收与转运能力[17]，计算公式如下：

富集系数=植物体内污染物积累含量/底物浓度

转运系数=植物叶片污染物积累含量/植物根部污染物积累含量以上实验数据均采用3次平行试验的平均值±标准差，运用SPSS 20.0中的单因素方差分析(One-way ANOVA)对不同浓度[C4mim]Br对空心菜生理生化指标及其吸收累积差异性进行统计分析，并进行LSD显著性检验，用Origin8.5进行绘图。

2 结果与分析(Results and analysis)

2.1 [C4mim]Br对空心菜生长的影响

2.1.1 [C4mim]Br对空心菜根长及株高的影响

植物的根以及株高的变化量是最能直观表达植物生长状况的指标。由图1可知，在整个实验周期内，空心菜整体的生长随着培养时间保持着不断增加的趋势。空心菜在[C4mim]Br低浓度处理下的生长过程中，根长(图1A)和株高(图1B)与空白对照相比，并未受到显著的抑制(P>0.05)。而在高浓度处理下(2 mg·L-1和5 mg·L-1)，空心菜的这2项生长指标与空白对照相比差异显著(P<0.05)，在2 mg·L-1和5 mg·L-1的高浓度[C4mim]Br处理下，空心菜的根部的生长量分别占空白对照的80%和71%，株高的生长量分别占空白对照的81%和75%。

图1 不同浓度[C4mim]Br对空心菜根(A)和株高(B)的影响注：图中同一天不同字母表示在0.05水平上差异显著，下同。Fig. 1 Effect of [C4mim]Br on root length (A) and plant height (B) of Ipomoea aquatica ForskNote: Different letters on the same day indicate significant differences at the level of 0.05, the same below.

图2 不同浓度[C4mim]Br对空心菜鲜重的影响(A)及空心菜生长抑制率与浓度的关系(B)Fig. 2 Effect of [C4mim]Br on the fresh weight of Ipomoea aquatica Forsk (A), and the relationship between growth inhibition rate and [C4mim]Br concentration (B)

图3 不同浓度[C4mim]Br对空心菜叶绿素含量的影响Fig. 3 Effect of [C4mim]Br on chlorophyll content of Ipomoea aquatica Forsk

图4 不同浓度[C4mim]Br对空心菜MDA含量的影响Fig. 4 Effect of [C4mim]Br on MDA content of the Ipomoea aquatica Forsk

图5 不同浓度[C4mim]Br对空心菜根系活力的影响注：TTC表示氯化三苯基四氮唑。Fig. 5 Effect of [C4mim]Br on the root activity of Ipomoea aquatica ForskNote: TTC stands for triphenyl tetrazolium chloride.

2.1.2 [C4mim]Br对空心菜生物量的影响

由图2A可知，在实验中后期(6～12 d)各浓度处理下空心菜生物量的增加量与空白对照差异显著(P<0.05)。[C4mim]Br处理组浓度由低到高，与空白对照相比空心菜生物量分别减少了8%、12%、29%、41%。生物量变化趋势与空心菜根及株高变化总体趋势相一致，再次表明抑制效应具有典型的剂量依赖性。根据生物量计算生长抑制率，用Logistic模型对曲线进行拟合，发现5 mg·L-1[C4mim]Br对空心菜抑制率最高为63%，经[C4mim]Br处理后，空心菜生物量的EC50值为1.64 mg·L-1(图2B)。

2.2 [C4mim]Br对空心菜生理学指标的影响

2.2.1 [C4mim]Br对空心菜叶绿素含量的影响

叶绿素是植物进行光合作用的色素，叶绿素含量的高低在一定程度上反映了光合作用水平的高低。由图3可知，随着培养时间的延长空白对照组中叶绿素含量变化不显著，而不同浓度的[C4mim]Br处理组中叶绿素a和叶绿素b的含量却在不断下降，并且随[C4mim]Br浓度升高下降趋势越明显。实验初期高浓度处理下(5 mg·L-1)空心菜叶片中叶绿素a和叶绿素b的含量分别占对照组的88%和91%，而到实验末期仅占对照的54%和64%。叶绿素的含量与[C4mim]Br处理浓度呈显著负相关(Rchl a= -0.890，Rchl b= -0.885，P<0.05)。

2.2.2 [C4mim]Br对空心菜叶片MDA含量的影响

MDA是膜质过氧化的最终产物，MDA含量的高低可以表示细胞膜损伤程度。本研究发现，空心菜叶片中MDA含量随[C4mim]Br浓度的升高而增加(图4)，低浓度处理时MDA含量有小幅度的增加，但高浓度[C4mim]Br处理时空心菜体内MDA含量急剧增加，与空白对照组有显著差异(R= 0.949，P<0.05)。通过12 d处理后，在[C4mim]Br处理浓度为0.5 mg·L-1时，MDA含量从空白对照组的26 nmol·g-1增加到38 nmol·g-1，在[C4mim]Br处理浓度为5 mg·L-1时，空心菜体内MDA含量达到最高，是空白对照的4倍。

2.2.3 [C4mim]Br对空心菜根系活力的影响

植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的生长情况和活力水平直接影响地上部的营养状况，根系活力越高植物生长越旺盛。由图5可知，空心菜根系活力随[C4mim]Br浓度的升高呈显著负相关(R=-0.903，P<0.05)。在实验初期，在0.5 mg·L-1[C4mim]Br处理中，空心菜根系活力与空白对照无显著差异(P>0.05)，其余处理浓度均显著低于对照组(P<0.05)。随着时间的推移，不同浓度的[C4mim]Br处理的空心菜根系活力均出现逐渐下降的趋势，经12 d处理[C4mim]Br处理浓度由低到高与对照的差异都显著(P<0.05)，并且仅占空白对照的85%、82%、53%、42%。

2.3 空心菜对[C4mim]Br的吸收

由图6可见，在整个实验过程中，水体中的[C4mim]Br含量可能受到空心菜根系的吸收、离子液体的光降解以及容器的吸附等综合作用，从而引起其浓度的下降。通过前期实验，确定容器的吸附作用可忽略不计。无植物栽培的5 mg·L-1[C4mim]Br的光解对照实验表明，在本实验条件下，水体中[C4mim]Br的光降解可忽略，因此[C4mim]Br浓度的降低以空心菜的吸收为主。经12 d处理后，空心菜对0.5、1、2、5 mg·L-1[C4mim]Br吸收分别为9%、7.8%、6.8%、5.6%；而前3天吸收分别为5.4%、4.3%、3%、2.4%，占到了所吸收量的60%、55%、44%、42.8%。结果显示[C4mim]Br浓度越高，空心菜吸收率越低的趋势，而污染物浓度过高会引起植物根细胞膜的破坏，从而影响植物根系对污染物的吸收。随着培养时间的延长和处理浓度的升高，[C4mim]Br对空心菜的毒性作用加强，空心菜根系细胞膜受损程度严重，进而抑制了空心菜对[C4mim]Br的吸收。

2.4 [C4mim]Br在空心菜体内的积累特性

在不同浓度[C4mim]Br处理12 d的过程中，每隔3天分别收集空心菜根部和地上部分，并检测不同组织内部积累的[C4mim]Br浓度。结果表明空心菜可以通过根部吸收[C4mim]Br，并转运至空心菜的地上组织。当处理浓度为5 mg·L-1时，根部积累量为27.92 μg·g-1FW，地上部分积累量为12.08 μg·g-1FW，根部对[C4mim]Br积累量是地上部分积累量的2.3倍(图7)。[C4mim]Br在根部和叶片中的积累量与浓度呈显著性正相关(R=0.951，P<0.05)，并且实验前3天的植物总积累量是实验结束时植物总积累量的38%，随着时间的推移，相同浓度处理下，虽然空心菜体内[C4mim]Br积累量在增加，但是增加幅度减弱，而富集系数与转运系数是衡量空心菜对[C4mim]Br吸收和转运能力的重要指标，本实验中空心菜对[C4mim]Br的富集系数(表1)与空心菜吸收[C4mim]Br的特性相吻合，在0.5～5 mg·L-1浓度范围内逐渐降低，并且空心菜的富集系数与转运系数均小于1，说明空心菜对[C4mim]Br的吸收能力较弱。

图6 空心菜对不同浓度[C4mim]Br的吸收Fig. 6 Uptake of [C4mim]Br by Ipomoea aquatica ForskNote:C stands for measured concentration; C0 stands for initial concentration.

表1 空心菜对不同浓度的[C4mim]Br的富集系数和转运系数Table 1 Enrichment coefficients and translocation factors of [C4mim]Br in different parts of Ipomoea aquatica Forsk

注：表中同一列不同字母表示在0.05水平上差异显著。

Note: Different letters in the same column indicate significant differences at the level of 0.05.

图7 不同浓度[C4mim]Br在空心菜不同部位的积累含量Fig. 7 Accumulation of [C4mim]Br in different parts of Ipomoea aquatica Forsk

3 讨论(Discussion)

植物受到外来污染物的胁迫后会出现生长缓慢、叶片变黄等毒害症状。毒理学实验的结果能直观反映植物对外来污染物毒性的耐受能力[18]。本研究显示，随着[C4mim]Br浓度的不断增加，空心菜根部变为褐色，根长以及株高的生长缓慢，空心菜各生长指标受到明显的抑制。前人研究报道在玉米种子幼苗的生长过程中，随[C8mim]Br浓度提高，玉米植株受到抑制，这与本研究的结果相一致[19]。[C4mim]Br对空心菜的半最大效应浓度(EC50)值低于Matzke等[20]报道的对浮萍的半最大效应浓度，表明[C4mim]Br对空心菜的毒性相对较高。

叶绿素是植物光合作用的基础，植物叶片中叶绿素含量的高低可以间接表明植物是否受到有毒化合物的伤害[21]。本研究结果表明，随着时间的推移，叶绿素含量逐渐降低，说明随着离子液体处理时间和浓度的增加，离子液体破坏空心菜体内的叶绿体结构，降低叶绿素的合成量。Liu等[11]报道经咪唑氯盐类离子液体处理后，水稻叶绿素荧光从橙色变为黄色然后变为浅绿色，表明离子液体能够损伤水稻叶绿体类囊体。而类囊体膜是植物叶绿体光能吸收、传递和转换的基础结构，光合色素是类囊体膜的重要组成部分，因而当植物叶绿素a、b的含量下降时，从形态上观察植物会出现退绿、黄化等现象[22]。与本实验中空心菜叶片变黄相吻合。

植物在逆境环境中，体内的活性氧自由基会迅速积累，原有的活性代谢会失衡，膜脂质过氧化作用启动[23]，MDA含量增加，因此MDA含量的高低可以直接反映植物抗逆境生长能力的强弱。4个浓度的[C4mim]Br处理下，空心菜叶片中MDA的含量随[C4mim]Br的浓度升高而增加，可能是空心菜体内自由基累积，加剧了膜脂质过氧化过程，致使细胞膜结构和功能受到了严重损伤。

植物的根是抵御外来污染物入侵的第一道防线，植物健壮的根系呼吸作用强，其脱氢酶活力强；相反，当植物受到外界环境胁迫时，呼吸作用减弱，脱氢酶活力降低。根系活力的高低可以反映出植物抵御外界胁迫能力的高低[24]。在植物体内中，根系活力与根系质膜透性呈负相关[25]，本研究中[C4mim]Br抑制了空心菜的根系活力，因此可能根系质膜透性增大使细胞受到伤害，改变根系细胞膜的蛋白质成分，从而诱导蛋白质结构损伤，增加膜质过氧化速率，破坏细胞膜。此外，随着离子液体烷基侧链的增加会倾向于具有更强的疏水性，因而会增加其与细胞膜脂质双分子层和疏水性蛋白相互作用的可能[26]，从而使根系对其生长所需营养和其他离子如离子液体的吸收、转运能力下降[27]。

富集系数与转运系数能综合地反应空心菜吸收并在体内转移[C4mim]Br的能力，而离子液体化学稳定性强、难生物降解并且具有低挥发性，导致其进入生物体后较难以快速被生物降解或随叶片呼吸作用挥发到大气中，因此较易积累在植物体内。我们的实验结果表明空心菜对[C4mim]Br的富集系数小于1，空心菜并不是超积累植物。[C4mim]Br在根部的积累量是地上部分的2.3倍，根系是[C4mim]Br进入空心菜体内的首要门户，是[C4mim]Br的主要积累器官[28]。一般污染物进入植物根细胞后，会从植物的根部迁移扩散到植物地上组织，植物根部吸收了[C4mim]Br后，受木质部汁液的分布和细胞膜渗透率的影响，向体内其他部位迁移扩散[29]。细胞质膜呈负电性，这易于植物吸收[C4mim]+等阳离子[30]。植物吸收[C4mim]Br主要受根部质外体向凯氏带的水流动力驱动，最终转运至木质部汁液。化合物在水中和在富含脂质的细胞膜中的溶解性决定了其向根中迁移并随后转移至叶片的能力[31]。然而，由于离子液体亲水性极高，[C4mim]Br向植物内皮亲脂细胞膜的迁移过程十分缓慢，最终导致迁移效率的下降[32]。所以[C4mim]Br向空心菜地上组织中的迁移效率相对比较低，转运系数较小。

总而言之，在本研究中经过不同浓度的[C4mim]Br处理后，空心菜的生长和生理指标均受到了抑制，随着[C4mim]Br处理浓度的增加，空心菜生长变慢，叶片变黄，植株矮小，根系不发达，空心菜生物量、叶绿素含量和根系活力均下降，同时MDA含量增加。[C4mim]Br能被空心菜吸收进入体内，由于[C4mim]Br处理浓度越高对空心菜的毒害作用越强，导致空心菜吸收离子液体的能力随浓度的增加而下降。[C4mim]Br在空心菜根部的积累远大于在叶片内的积累，并且各部分含量随着[C4mim]Br处理浓度的升高而不断增加，由此可知，空心菜从根部吸收的离子液体会通过植物本身的运输作用，将[C4mim]Br运输至空心菜的地上部分。同时，本研究证实了离子液体并不完全是“绿色”化学品，环境水体中的[C4mim]Br离子液体可以利用空心菜的生长从根部进入到空心菜的其他部分中，它有通过食物链进入人体的可能性，需要研究者对其环境安全性进行更加全面的评估。