全氟辛烷磺酸对斑马鱼肝脏影响机制的代谢组学研究

姚丹，吴昊，江敏,3,*

1. 上海海洋大学海洋生态与环境学院，上海 201306 2. 上海海洋大学水产与生命学院，上海 201306 3. 上海市水产养殖工程技术研究中心，上海 201306

全氟辛烷磺酸(perfluorooctane sulfonate, PFOS)属于全氟化合物(fluorinated organic compounds, FOCs)，是一种持久性有机污染物，因其具有良好的表面活性、疏水性、疏油性，自1949年由3M公司研制以来，被广泛应用于工业生产和生活用品[1-3]。PFOS化学结构极其稳定，在生物体内难以被代谢排出，具有生物蓄积性，并且可远距离传播[4-5]。迄今为止在世界各地环境(如大气、水体、沉积物)[6-10]、动物[11-12]，甚至人的血清[13-14]、母乳[15]、脐带血[16]中，PFOS都有检出。已有大量研究表明PFOS会对生物心脏、肺、肝脏等多种脏器产生毒性作用，具有潜在的生态风险[17-24]。肝脏作为生物体主要的有毒物质代谢器官，同样是PFOS主要的靶器官，PFOS可在肝脏中蓄积，导致肝脏肿大、损伤。潘若雷等[25]研究发现PFOS可引起三角帆蚌肝胰腺显著的氧化损伤，且长期的PFOS暴露会造成肝胰腺细胞实质性损伤；王玲[26]实验表明PFOS暴露会引起小鼠肝脏内脂肪含量升高，肝糖原含量降低。党红蕾等[27]研究显示PFOS能引起半滑舌鳎肝细胞产生氧化应激，破坏生物膜系统，从而使细胞增殖和多种代谢途径受到抑制。

代谢组学(metabonomics)技术通过比较药物作用前后生物体液或组织代谢表达的变化，能较全面地反映生物体内源性代谢物质的整体及其变化规律，并且有着仅通过生物的较少组织样品便可获得大量信息的优势[28-29]。Kariuki等[30]运用代谢组学分析大型蚤(Daphniamagna)的PFOS暴露亚致死毒性，结果表明PFOS可破坏大型蚤的能量代谢，促进蛋白质降解，并确定了用于PFOS暴露下大型蚤健康评价的几种敏感代谢物指标。Yu等[31]利用代谢组学研究小鼠的大脑和肝脏发现，全氟辛酸(PFOA)会影响大脑中神经递质5-羟色胺、多巴胺、去甲肾上腺素和谷氨酸的浓度，导致肝脏的炎症，影响脂肪酸β氧化和生物合成。近年来，代谢组学已在药物机理[32-33]、临床诊断[34-35]、物种差异研究[36]、毒理学[37-38]、营养学[39-40]等研究领域得到了广泛的应用。目前，未见运用代谢组学探究全氟辛烷磺酸对鱼类低剂量的毒性机理的报道。本实验将模式生物斑马鱼置于不同PFOS暴露浓度水平下，取肝脏进行代谢组学检测与分析，以筛选显著性差异代谢物和分析相关代谢通路，为在代谢组学层面探究PFOS对水生生物肝脏毒性机理提供新的思路。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

实验斑马鱼购自上海奇溢自然旗舰店，鱼龄3个月，体长(1.4 ± 0.2) cm，为同批亲本所育。

所用仪器包括：气相色谱-质谱联用仪(Agilent，7890A/5975)；全自动样品快速研磨仪(上海净信科技，Tissuelyser-24)；Eppendorf离心机(Centrifuge 5810 R)；高速离心浓缩仪(Labogene ScanSpeed40)；恒温混匀仪(杭州瑞诚仪器有限公司，TS100)。

实验药品如下：全氟辛烷磺酸钾(Sigma-Aldrich公司，98%)；HPLC级甲醇(Sigma-Aldrich公司)；HPLC级水(Sigma-Aldrich公司)；N,O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺(BSTFA，含1%TMS)(上海安谱实验科技股份有限公司)；吡啶(分析纯，Sigma-Aldrich公司)；甲氧基胺盐酸盐(分析纯，Sigma-Aldrich公司)；2-氯苯丙氨酸(Sigma-Aldrich公司)。

1.2 实验方法

正式实验前，斑马鱼于80 L水体中(水箱体积67 cm×50 cm×41 cm)暂养一周。一周后选取健康、活泼的斑马鱼80条，分为4组，分别为对照组和PFOS浓度为10、100、250 μg·L-1的实验组，每组20条，每箱水体20 L(水箱为聚乙烯材质，体积(47 cm×32 cm×25.5 cm)。实验前斑马鱼12 h禁食，实验为期40 d。养殖用水为充分曝气除氯的自来水，控制水温(25±2) ℃，光照:黑暗时间为14 h∶10 h，全天候充气以维持水中溶解氧处于饱和水平，每天定时喂食薄片饲料(宠物家族)2次，喂食30 min后半换水以保持PFOS含量的稳定，实验期间及时清理残饵和死亡斑马鱼。实验结束时各组斑马鱼死亡数分别为0、3、2和4尾。第40天早上取样。将斑马鱼置于冰上冷冻麻醉，迅速取其肝脏，每组取12尾鱼，每3尾斑马鱼的肝脏混合作为1个样品(即每组4个样品)，样品分别置于离心管中，液氮冷冻。在装有样品的离心管内分别加入20 μL 0.3 mg·mL-12-氯苯丙氨酸(内标)和800 μL甲醇水提取液(V甲醇∶V水=4∶1)，在全自动样品研磨仪上匀浆处理后置于-20 ℃冰箱静置10 min，取出后1 000 r·min-1离心5 min，吸取600 μL上清液于进样瓶中，置于高速离心浓缩仪3 h挥干溶液。在装有挥干样品的进样瓶中分别加入100 μL 15 mg·L-1甲氧胺盐酸盐吡啶溶液和N,O-双(三甲基硅烷基)乙酰胺溶液，之后置于恒温混匀仪78 ℃衍生化1 h，衍生化结束后于气相色谱-质谱联用仪进样检测。

1.3 气相色谱-质谱联用仪条件

气相色谱-质谱联用仪(Algilent，7890A/5975)检测使用DB-17MS毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；进样体积为2 μL，进样温度为260 ℃，不分流进样；采用程序升温，初始温度为60 ℃，以10 ℃·min-1的速度3 min升到315 ℃，270 ℃吹扫3 min，载气为高纯氦气(纯度>99.999%)，恒定流速3.0 mL·min-1；质谱接口温度280 ℃，EI离子源，电子能量70 eV，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，质量扫描范围30～550 amu；以全扫描模式获得总离子流色谱图。

1.4 数据分析

气相色谱-质谱联用仪获得的总离子流色谱图原始数据由Agilent Mass Hunter Workstation (Qualitative Analysis B.07.00)、MS定量分析软件进行峰对齐和峰积分等处理，最终获得一个含有化合物编号、保留时间和响应值的Excel表格。将表格中的数据整理成含有实验组编号、化合物编号、响应值的Excel表格，所得表格导入SIMCA-P 14.1软件，采用无监督的主成分分析(PCA)和有监督的正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)将数据标度化、中心化处理，利用正交信号校正技术过滤代谢物变量信息并筛选出差异代谢物。

1.5 代谢物的鉴定及代谢途径的分析

将上述软件筛选得到的差异代谢物，对照相应出峰时间，利用MSD ChemStation Data Analysis Application软件查询数据库NIST Mass spectral Database，得到高匹配度的化合物，根据化合物结构图，查询ChemSpider的Structure Search (http://www.chemspider.com/StructureSearch.aspx)版块，HMDB (http://www.hmdb.ca)，KEGG (http://www.genome.jp/kegg/compound)数据库，根据化学分子式结构图进行确定。将鉴定得到的代谢物整理出实验组名称、代谢物名称、响应值Excel表格，导入MetaboAnalyst 3.0在线分析软件(http://www.metaboanalyst.ca/faces/home.xhtml)，对全氟辛烷磺酸影响的代谢通路进行分析。

2 结果(Results)

2.1 代谢物图谱分析

此次实验共获得177个代谢物编号，将不同浓度PFOS暴露下含有实验组编号、化合物编号、响应值的斑马鱼肝脏数据导入SIMCA-P软件，首先在PCA状态下分析对照组与3个实验组肝脏组织的代谢谱，可得图1。图1显示，肝脏数据矩阵空间分布对照组与实验组均完全分开，表明从代谢水平上可以观察到PFOS暴露所产生的影响。随后，在OPLS-DA条件下对肝脏组织数据进行进一步分析，可得图2(a.R2X=0.848，Q2=0.752；b.R2X=0.815，Q2=0.824；c.R2X=0.867，Q2=0.816，R2表示OPLS-DA模型累计方差值，反映模型的拟合程度，Q2表示累计交叉有效性，反映模型的预测能力)，OPLS-DA状态下模型对自变量的拟合能力和预测能力皆显示良好，对照组与实验组在肝脏代谢谱中均可以明显区分。

图1 对照组与10、100、250 μg·L-1 PFOS实验组斑马鱼肝脏PCA得分图注：C为对照组，T1、T2、T3分别为PFOS浓度10、100和250 μg·L-1的实验组。Fig. 1 PCA scores plots of zebrafish liver in control group and experimental groups of PFOS at 10, 100 and 250 μg·L-1 Note: C stands for control group; T1, T2 and T3 stand for experimental groups of PFOS at 10, 100 and 250 μg·L-1, respectively.

图2 对照组与10、100、250 μg·L-1实验组斑马鱼肝脏OPLS-DA得分图注： C为对照组，T1、T2、T3分别为PFOS浓度10、100和250 μg·L-1的实验组。Fig. 2 OPLS-DA scores plots of zebrafish liver in control group and experimental groups of PFOS at 10, 100 and 250 μg·L-1 Note: C stands for control group; T1, T2 and T3 stand for experimental groups of PFOS at 10, 100 and 250 μg·L-1, respectively.

2.2 差异代谢物

为了筛选出能更好反映PFOS影响的差异代谢物，将对照组分别与各个实验组进行比较，在OPLS-DA分析结果的S-plot图中，选择∣p(corr)∣>0.5，∣p∣>0.1，VIP值>1.0且P值<0.05的差异代谢物。通过NIST谱库检索，并且利用HMDB、KEGG等在线数据库对差异代谢物的结构、名称进行比对确认，与对照组相比，PFOS浓度为10 μg·L-1的斑马鱼肝脏中筛选出4种发生显著性变化的代谢物，包括牛磺酸、磷酸乙酰胺、β-D-葡萄糖、油酸；PFOS浓度为100 μg·L-1的斑马鱼肝脏中筛选出5种代谢物发生显著性变化，分别为牛磺酸、β-D-葡萄糖、棕榈酸、油酸、胆固醇；PFOS浓度为250 μg·L-1的斑马鱼肝脏中有5种代谢物发生显著性变化，分别为牛磺酸、β-D-葡萄糖、乳酸、甘油-3-磷酸、磷酸乙酰胺(表1)。

表1 不同浓度PFOS实验组斑马鱼肝脏中的显著性差异代谢物Table 1 Significantly changed metabolites of zebrafish liver in experimental groups of PFOS

注：↑为上调，*为差异显著(P<0.05)，**为差异显著(P<0.01)。

Note: ↑ stands for upregulation; * stands for significant difference (P<0.05); ** stands for significant difference (P<0.01).

图3 10(A)、100(B)、250(C) μg·L-1 PFOS暴露对斑马鱼肝脏代谢通路的影响注： A图中a1.牛磺酸和亚牛磺酸代谢；b1.鞘脂代谢；c1.甘油磷脂代谢；d1.糖酵解或葡萄糖生成；B图中a2.原代胆汁酸生物合成； b2.牛磺酸和亚牛磺酸代谢；c2.类固醇生物合成；d2.类固醇激素生物合成；e2.糖酵解或葡萄糖生成； C图中a3.牛磺酸和亚牛磺酸代谢；b3.甘油磷脂代谢；c3.甘油脂代谢；d3.鞘脂代谢；e3.糖酵解或葡萄糖生成。Fig. 3 10(A), 100(B), 250(C) μg·L-1 PFOS impacts on zebrafish liver metabolism pathwayNote: in Figure A, a1. Taurine and hypotaurine metabolism; b1. Sphingolipid metabolism; c1. Glycerophospholipid metabolism; d1. Glycolysis or Gluconeogenesis. In Figure B, a2. Primary bile acid biosynthesis; b2. Taurine and hypotaurine metabolism; c2. Steroid biosynthesis; d2. Steroid hormone biosynthesis; e2. Glycolysis or Gluconeogenesis. In Figure C, a3. Taurine and hypotaurine metabolism; b3. Glycerophospholipid metabolism; c3. Glycerolipid metabolism; d3. Sphingolipid metabolism; e3. Glycolysis or Gluconeogenesis.

2.3 代谢通路分析

各实验组PFOS暴露影响力大于零的代谢途径见图3(A、B、C分别为PFOS暴露浓度10、100、250 μg·L-1组)。结果显示10、100、250 μg·L-1PFOS浓度组皆影响牛磺酸和亚牛磺酸代谢途径和糖酵解或葡萄糖生成，且对牛磺酸和亚牛磺酸代谢途径影响较大。

3 讨论(Discussions)

已有研究表明PFOS会影响斑马鱼肝脏脂代谢，如胡芹[41]、崔燕[42]均在PFOS暴露后的斑马鱼肝脏切片中观察到大量脂肪空泡。本研究同样表明PFOS暴露可影响斑马鱼肝脏脂代谢。PFOS浓度10 μg·L-1和100 μg·L-1组的斑马鱼肝脏中均筛选出具有显著性差异的饱和脂肪酸，PFOS浓度为10 μg·L-1组筛选出油酸，PFOS浓度为100 μg·L-1组筛选出油酸、棕榈酸，而PFOS浓度为250 μg·L-1的实验组斑马鱼肝脏中则未筛选出饱和脂肪酸。推测相比高浓度的PFOS，较低浓度PFOS暴露更倾向于促进饱和脂肪酸的积累，可能对于肝脏脂肪代谢的影响更大。王玲[26]在硕士论文中曾研究PFOS暴露对小鼠肝脏脂肪含量的影响，结果显示PFOS暴露后肝脏脂肪含量相比对照组有所升高，低剂量组脂肪含量显著升高，高剂量组虽有升高但不显著，与本实验的研究结果相一致。在筛选出的饱和脂肪酸中，油酸随着PFOS浓度的升高由P<0.01水平显著升高变为P<0.05水平显著升高，再到变化不显著(P>0.05)，显示出一定的剂量-效应关系，可作为PFOS对斑马鱼肝脏胁迫的潜在标记物。

牛磺酸是一种含硫非蛋白氨基酸，来源于半胱氨酸氧化脱羧。肝脏中的牛磺酸是某些胆酸的组成部分，主要作用是与胆汁酸结合形成脂肪吸收所必需的牛磺胆酸。另外，牛磺酸还具有抗氧化损伤的作用，已被证明能显著逆转PFOS处理的PC12细胞活性降低和ROS增加[43-45]。实验组中，随着PFOS暴露浓度的升高，筛选出的牛磺酸由P<0.05水平显著上升变为P<0.01水平显著上升，表明两者之间具有一定剂量-效应关系，可作为斑马鱼在PFOS胁迫下肝脏的潜在标记物。PFOS可造成肝脏氧化损伤[21,46]，250 μg·L-1PFOS组斑马鱼肝脏中牛磺酸呈显著性上升(P<0.01)，而饱和脂肪酸并未随牛磺酸出现显著上升，由此推测高浓度PFOS的暴露下肝脏中上调的牛磺酸可能主要发挥对抗氧化的损伤作用。

葡萄糖为能量的主要来源，实验组与对照组相比，斑马鱼肝脏中β-D-葡萄糖均显著上升(P<0.01)，通过通路分析其涉及的代谢路径为糖酵解或葡萄糖生成，提示PFOS会干扰肝脏糖代谢。

综上所述，斑马鱼在PFOS浓度为10 μg·L-1、100 μg·L-1、250 μg·L-1溶液中暴露40 d后，对其肝脏的牛磺酸和亚牛磺酸代谢、糖酵解或葡萄糖、部分脂类代谢均产生影响。其中，对牛磺酸和亚牛磺酸代谢影响较大，较低浓度PFOS暴露更倾向于促进肝脏脂肪的累积；显著性差异代谢物牛磺酸、葡萄糖、油酸可作为PFOS造成斑马鱼肝脏代谢异常的潜在标记物，实验结果为进一步研究PFOS对水生动物肝脏毒性提供了一定的理论依据。本实验中使用的代谢组学技术为气相色谱质谱联用技术，其优势在于具有高分辨率和高灵敏度，分析成本较低，可重复性进样，具有高质量的商业标准谱库，能对代谢物定性和定量分析，局限性在于需要衍生化处理，不能获得不稳定或是难以挥发的代谢物信息。除此之外，目前主要的代谢组学技术还包括液相色谱质谱联用技术、核磁共振技术，单独使用时亦是各有优缺点，但是如果将它们联合起来则可发挥更强大的作用，这也是现代仪器技术分析手段发展的一个趋势，日后深入研究PFOS毒理机制代谢组学可以以此为切入口[52-53]。