一种传统发酵酵子细菌多样性及挥发性发酵产物分析

马凯,武会娟,刘悦,陈尔凝,杜美红，李太华,王衍生,高丽娟,*

1(北京市理化分析测试中心，北京市基因测序与功能分析工程技术研究中心，北京市食品安全分析测试工程技术研究中心，北京，100094) 2(北京旗舰食品集团有限公司，北京，100194)

馒头作为传统发酵面食的典型代表，在我国特别是北方地区日常生活中占有重要的地位。馒头的发酵剂大致分为两类，一类是传统的发酵剂，一般被称为“酵子”“老面”及“面肥”等[1]，另一类是现代工业化生产的活性干酵母、鲜酵母及馒头自发粉等。活性干酵母为单一菌种发酵，与传统发酵剂的混菌体系发酵相比，发酵的馒头风味平淡、香气不佳，总体的感官品质低，复蒸性能差[2]。传统馒头发酵酵子中除含有酵母菌外，还有包括乳酸菌在内的丰富的细菌菌群[3]，其在面团发酵过程中起到协同酵母菌进行糖化、蛋白分解、酯化、产气的作用，在丰富了发酵过程中产生的代谢物质和增加了营养元素的同时，还能够给醒蒸后的馒头增添独特的香味[4]，因而发酵的面食感官品质更佳。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 酵子样本、面粉及干酵母

酵子样品取自北京地区一优质传统馒头发酵酵子，低温运输至实验室，立即进行菌株分离培养；高活性干酵母(安琪酵母(赤峰)有限公司)；面粉(北京粮海食品有限公司旗舰面粉)。

1.1.2 培养基及主要试剂

营养琼脂培养基(NA)、MRS培养基，北京陆桥技术股份有限公司。

TaqDNA聚合酶、DL2000 Marker，宝生物工程大连有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒，天根生化科技有限公司；TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit， Takara(大连)；pGEM-T克隆试剂盒、JM109感受态细胞，Promega(美国)；HinfI、MspI，New England BioLabs(美国)。

IF-A接种液、AN-IF接种液、GEN III微孔板、AN微孔板、BUG培养基、BUA培养基，Biolog公司(美国)；其他化学药品均为进口分析纯产品。

其他有机试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器

ZSD-A1090生化培养箱，上海智城分析仪器有限公司；厌氧罐，三菱，日本；Gen III Microstation自动微生物鉴定系统，Biolog(美国)。C1000TM Thermal Cycler PCR仪、UNIVERSAL HOOD II凝胶成像系统，Bio-Rad(美国)；固相微萃取手动进样手柄、DVB/CA/PDMS(2 cm，50/30 μm)纤维头，Supelco(美国)；2010气相色谱质谱联用仪，Shimadzu(日本)。

1.2 菌株的分离纯化及鉴定

1.2.1 菌株分离纯化及形态学观察

从酵子内及酵子表面各取5 g面，合并转置于盛有90 mL磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.4)的无菌三角瓶内，充分振荡30 min，使酵子样品尽可能分散均匀制成酵子悬液。梯度稀释后分别涂布到NA和MRS培养基上，分别置于36 ℃(NA)和30 ℃(MRS)培养48 h(MRS培养基置于厌氧罐中培养)。进一步纯化后观察其在培养基上的培养特征；并利用光学显微镜进行菌体形态特征观察。

1.2.2 菌株16S rDNA序列分析

提取分离菌株基因组DNA，并以此DNA为模板，利用细菌通用引物针对性地对16S rDNA序列进行扩增，PCR条件参见文献[5]。序列测序后使用Lasergene软件内部的SeqMan对测序结果进行拼接及引物序列校准。将拼接后的序列提交到NCBI数据库进行BLAST比对。

1.2.3 菌株的生理生化特性分析

将从NA和MRS培养基上分离得到的菌株分别使用Biolog的GEN III板(需氧菌)或AN板(厌氧菌)进行碳源利用情况检测，通过微孔板上显紫色孔所产生的指纹图谱同Biolog数据库中的数据进行比对，得到针对95种碳源利用情况最相似的鉴定菌株。

1.3 克隆文库分析

1.3.1 核酸提取及扩增

按照1.2.1方法制备酵子悬液。将酵子悬液分3次转移至50 mL离心管中，50 r/min离心5 min，取上清液至新50 mL离心管中，12 000 r/min离心5 min，弃上清，提取试剂盒提取酵子中总DNA。

以酵子总DNA为模板，针对性地对其中细菌16S rDNA序列进行扩增，PCR扩增体系及PCR反应条件同1.2.2，产物用1%的琼脂糖进行检测。

1.3.2 16S rDNA克隆文库构建

将PCR产物纯化后，参照文献[6]构建文库。

1.3.3 扩增性rDNA的限制酶切分析(Amplified rDNA Restriction Analysis，ARDRA)

使用限制性内切酶HinfI、MspI进行酶切分析，具体方法参见文献[6]。电泳图用Quantity one软件分析，筛选出不同带型克隆子。挑取酶切分型不同的克隆子进行双向测序。使用Lasergene软件内部的SeqMan对测序结果进行拼接及引物序列校准。将拼接后的序列提交到NCBI进行BLAST比对。

1.4 馒头样品制作方法

老酵馒头及酵母馒头做法参照文献[4]。

1.5 挥发性代谢产物分析

1.5.1 固相微萃取操作方法及气相色谱-质谱联用检测条件

准确称取500 mg馒头样品(每种馒头设置3个重复)于15 mL气相顶空样品瓶中，加入5 mL预冷(4 ℃)去离子水，加终浓度为10 mmol/L内标4-甲基-2-戊醇(0.001 0 g/mL)。

固相微萃取操作方法及样品检测用的色谱及质谱条件同参考文献[4]方法一致。

1.5.2 挥发性产物的鉴定及数据分析

对检测结果的定性分析，以计算机检索NIST08谱库、人工解析图谱，结合文献对照共同确定挥发性成分。通过将检测到的挥发性物质与内标物峰面积的对比确定挥发性成分的含量。

使用SPSS(PASW Statistics 18.0，美国)对挥发性成分的含量进行单因素变量分析(Analysis of Variance，ANOVA)，统计量采用描述性和方差同质性检验，显著性p<0.05。采用主成分分析方法对两种馒头样品进行分析，以期发现两种馒头之间的异同，及造成差异的成分。

2 结果与分析

2.1 分离培养鉴定结果

通过传统微生物分离培养共获得26株菌株，其菌落及菌体形态特征如表1中分析所示。其PCR产物测序结果Blast比对结果见表1中16S rDNA序列相似性分析。

根据形态学观察结果及16S rDNA测序比对结果，选取非重复菌种的代表菌种共计5株提交GenBank并获得登录号KX247764-KX247768，如表1所示。

将5株菌株进行Biolog生化鉴定，得到最相似的鉴定菌株ID。其中MRS-3和NA-20鉴定结果中SIM值没有大于0.5的比对菌株，参照其测序鉴定结果(Weissellacibaria和Acetobactermalorum)发现，Biolog数据库中没有此2株菌。

通过以上分析，查询相关分类书籍[7-8]并结合相关文献[9-10]，综合结果见表1。

2.2 克隆及酶切(ARDRA)鉴定结果

经琼脂糖电泳验证后去除4个假阳性克隆子(见图1-A)，Quantity one软件分析(见图1-B)筛选出不同带型克隆子进行测序，将序列提交GenBank，获得登录号KX247769-KX247777，见表2。将表1与表2中菌株序列合并构建系统发育树，如图2所示。

表1 培养法分离菌株的鉴定Table 1 Identification of bacteria isolated from Jiaozi

表2 克隆文库-扩增性rDNA限制酶切法微生物多样性分析Table 2 Clone-ARDRA analysis of bacteria in Jiaozi

M-DL2000 Marker; H7-空白对照图1 克隆子PCR扩增产物(A)及ARDRA双酶切反应(B)电泳结果Fig.1 Clones PCR products(A)and ARDRA(B)

通过ARDRA法鉴定得到的菌种能够包含所有分离培养的菌种，通过观察文库丰度，分离培养得到的5种菌在克隆文库中所占丰度均较高，丰度总和达95.6%，表明分离培养方法得到了传统发酵酵子中最优势菌株。同时，在此次构建克隆文库筛选优势菌群过程中，发现的微生物种类不是非常多，且未发现不可培养微生物，这可能与发酵酵子本身特质相关。一方面酵子在制作完成后一般处在半封闭状态，即封存保留以待使用，与外界环境接触的机会较少，不会出现制作酵子时再次大规模引入微生物的情况；另一方面发酵酵子经过不断的传代、留种、发酵[11]，会逐步形成特色的优势微生物——乳酸菌，乳酸菌的大量存在会使酵子的pH值降低，使另一些微生物不适宜生存[12]，这种功能和自然两方面的选择压力促成了优质传统发酵酵子的特点：微生物菌群结构稳定且发酵能力较强。

实验结果显示，乳酸菌是最优势菌群，Weissella和Lactobacillus两个属所占丰度共计占到整个克隆文库的90%以上，芽孢杆菌、醋酸杆菌及明串珠菌并不是优势菌群，这一结果与前人对多种传统发酵酵子细菌多样性研究结果相一致，即乳酸菌为优势菌群，还包括芽孢杆菌、醋酸杆菌等在内的多种细菌[13]。但本研究也发现了“种属”层面的差异。前人研究结果中乳酸菌占有优势，但是集中在乳杆菌属，以发酵乳杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌及旧金山乳杆菌等最为常见[14-17]。1993年COLLIN[18]等结合传统表型分型方法和16S rRNA序列测序分析方法，将一些原属明串珠菌和非典型的异型发酵乳杆菌，单独划为一个簇群，并第一次提出Weissella的名称，其在微生物学、发酵工业及食品加工等方面的作用近年来开始受到研究者的关注[19]。本研究中Weissella比乳杆菌属更具优势，而导致这种“种属”层面差异的原因可能是酵子的制作原料和环境。有研究显示制作馒头用的酵子的菌种的最初来源可能是面粉、空气和水[20]，酒曲制作酵子的菌种还会从酒曲中引入[1]，而酒曲中含有丰富的微生物资源[21]。本研究选择的优质馒头发酵酵子是酒曲曲种添加水和特定的面粉，经揉制和发酵，并通过多次传代制作而来，故其微生物菌群结构既较单一酵母菌剂丰富，又与一般传统发酵酵子有所不同。

2.3 馒头中挥发性代谢产物分析

采用传统发酵酵子作为发酵剂制作的馒头(QJ馒头)，与市售活性干酵母发酵剂制作的馒头(AQ馒头)在相同的取样条件和分析条件下进行比较，GC-MS分离鉴定两种不同菌剂制作馒头样品中挥发性风味成分的种类及相对含量，结果分别见表3。

表3 馒头中挥发性化合物含量Table 3 Concentration of volatile compounds in CSB

续表3

编号化合物简称质量浓度(平均值±标准偏差)QJAQ40壬醛Nal1．40±0．17a1．92±0．44a41癸醛Deal1．28±0．32a1．13±0．43a42苯甲醛BALD0．39±0．10and432⁃壬烯醛Noal0．51±0．15a0．41±0．11a442，4⁃癸二烯醛Decal0．35±0．11and酯类45反⁃β⁃戊酸松油酯PT2．14±0．53and46己酸乙酯HexE8．30±3．14a7．46±0．36b47乙酸己酯AH0．55±0．13a0．86±0．25a48己酸丙酯HP0．10±0．02a0．24±0．08b49庚酸乙酯HeE0．53±0．30a0．77±0．41a502⁃羟基丙酸乙酯PE0．20±0．08and51己酸丁酯HB1．68±0．41a4．28±1．03a522⁃甲基⁃丁酸己酯BHM0．67±0．20a1．48±0．40a53辛酸乙酯OE0．97±0．14a3．56±0．88a54己酸己酯HH0．51±0．15a0．41±0．09a553⁃苯丙酸⁃2，3⁃二氯苯酯PpD0．83±0．21a1．46±0．45a563⁃苯丙酸⁃3⁃氟苯基酯PpF0．91±0．24and574⁃乙基苯甲酸⁃2⁃乙基己酯EE0．21±0．07and58丙酸⁃2⁃甲基⁃3⁃羟基⁃2，4，4⁃三甲基戊基酯PM⁃HMP4．67±0．97a6．33±2．20a59丙酸⁃2⁃甲基⁃2，2⁃二甲基⁃1⁃(2⁃羟基⁃1⁃甲基乙基)丙酯PMHP3．64±1．09a3．67±0．89a酮类606⁃甲基⁃5⁃庚烯⁃2⁃酮HM0．14±0．04and612⁃(1⁃环戊⁃1⁃烯⁃1⁃甲基乙基)环戊酮CP0．05±0．02and62(Z)⁃6，10⁃二甲基⁃5，9⁃十一二烯⁃2⁃酮UDZ0．32±0．11and63二氢⁃5⁃戊基⁃2(3H)⁃呋喃酮FDP0．20±0．04and芳香类641，3，3⁃三甲基壬基苯BenT0．79±0．11and651，1’⁃(1，1，2，2⁃四甲基⁃1，2⁃亚乙基)二苯BTE0．77±0．22and66萘Nap0．26±0．10a0．28±0．12a672⁃甲基萘NapM0．27±0．06a0．32±0．12a68二甲基羟基甲苯BH0．14±0．05and691，2，3，5⁃四甲基苯B4Mnd0．34±0．07a其他类702⁃戊基⁃呋喃FP1．09±0．33a0．40±0．12b

注：平均值±标准偏差(3个重复的平均值)；nd：未检测到。

由表3可知，两种馒头一共检测出醇类20种，烃类15种，醛类9种，酯类15种，酮类4种，芳香类6种，其他类1种，共计70种挥发性成分。烷烃类物质属于高阈值的化合物，对馒头风味贡献很小[22]。

在馒头中一共检测出20种醇类，醇类具有特殊香气，赋予馒头香气作用较大[23]。酯类成分主要来源是酵母和细菌的代谢产物，以及在馒头蒸制过程中，有机酸和醇类的进一步发酵的产物(酯化反应)[24]。其中以己酸乙酯、己酸丁酯等短链脂肪酸为主，短链脂肪酸是已知的微生物代谢产物，尤其以乳酸菌代谢利用低聚糖后产生的代谢产物为主[25]。本次实验检出馒头中9种醛类和4种酮类挥发性成分，其中QJ馒头中9种醛类和4中酮类全部检出，AQ馒头没有检出酮类成分。醛类和酮类主要由高级醇氧化而来，或在发酵过程中由酯和氨基酸降解产生，其对馒头香味的形成有重要的影响[24]。含量最高己醛是一种具有青草气及苹果香味的成分[26]。

PCA分析(图3)显示PC1与PC2的累积方差贡献率为77.41 %，其中PC1和PC2的方差贡献率分别为65.18 %和12.23 %，说明两个主成分能够将QJ馒头和AQ馒头进行有效地区分，其中PC1的贡献率超过60.00%，说明两种馒头的挥发性成分在PC1上有明显区分，结合图4和表3分析，QJ馒头主要在NoneE、Bent、PpF、Pet、PT、HexM、PE、BTE、HepE及HB、BALD、EOB、CP、Hexl等10种醇类、5中醛类、4种酯类和4种酮类成分上与AQ馒头存在显著差异。

图3 馒头挥发性成分PCA分析图Fig.3 PCA analysis of volatile compounds in CSBs

2.4 馒头中挥发性成分差异的分析

本次实验选取的传统发酵酵子是馒头生产企业进行大规模馒头生产使用的酵子，由酿酒所用的酒曲制作而来，其制作的馒头具有“醇香”特点。本次实验的主成分分析发现，在20种醇类、15种酯类、9种醛类和4种酮类当中，QJ馒头与AQ馒头的差异主要在10种醇类、5种醛类、4种酯类和4种酮类成分方面。结合GC-MS定量分析，醇类在总含量上，QJ馒头(68.08 μg/g)高出AQ馒头(47.77 μg/g)42.52%，虽然醛类高出116.07%，但醛类总含量(10.89 μg/g)远低于醇类总含量，所以推测醇类是区分本次实验中两种馒头的标志物，这符合传统酵子制作的馒头“醇香”的感官特征，显示出除酵母菌种外，丰富的细菌菌种极大地增加了醇类的种类和含量。

其原理主要是小麦面粉中微生物可以利用的碳水化合物首先是淀粉和麦芽糖，其次是蔗糖、葡萄糖和果糖，连同一些三糖，如麦芽三糖和棉子糖[22]。对面团发酵最关键的酵母菌不能利用面粉中的淀粉、麦芽糖及三糖。结合表1中微生物菌种发现，传统发酵酵子中的食窦魏斯氏菌、融合魏斯氏菌、瑞士乳杆菌等乳酸菌及短小芽孢杆菌能够代谢麦芽糖等糖类并释放出葡萄糖、果糖等单糖[27]，短芽孢杆菌还能够分泌淀粉酶水解淀粉产生单糖[28]。在发酵过程中产生的单糖一部分被酵母菌代谢利用，用于细胞增殖，并产生CO2，使面团膨胀；一部分被乳酸菌代谢利用，经过同型发酵和异型发酵产生乳酸、醋酸、乙醇、CO2等[27]；同时，苹果醋杆菌能够有效利用糖类和酒精产生醋酸[29]。在酵母菌、乳酸菌、芽孢杆菌及醋酸杆菌菌体大量增殖发酵面团的同时，产生的次级代谢产物能够影响酵子的风味和质地。

小麦面粉含有蛋白质水解产生多肽和氨基酸，有研究表明乳酸菌对一些非常规底物(如氨基酸、多肽)的强制性利用也可能产生丙酮酸和乳酸，提高面包的风味[30]，同时酵子发酵过程中乳糖的降解产生醋酸和CO2，也会影响酵子的风味和质地[31]。

3 结论

传统馒头发酵酵子是一个丰富的微生物系统，相比较菌种单一的酵母粉，传统馒头发酵酵子中富含的细菌在馒头醒发制作过程中能够产生丰富的代谢产物[8]，主要表现在醇类的种类更为丰富，含量更高。本研究系统地分析了一种优质传统馒头发酵酵子中菌群结构特点，获得了一批菌株资源，这些资源中有些菌株可能具有良好的代谢性能，为下一步筛选合适、优异的混合发酵菌株，构建稳定、成熟的发酵体系，进而为传统发酵主食的工业化改进提供了基础数据。

[1] 张国华,何国庆.我国传统馒头发酵剂的研究现状[J].中国食品学报,2012，12(11):115-120.

[2] 杨敬雨,刘长虹.中国传统酵子的工业化[J].食品研究与开发,2007(2):164-166.

[3] ZHANG Jia-chao,LIU Wen-jun,SUN Zhi-hong,et al.Diversity of lactic acid bacteria and yeasts in traditional sourdoughs collected from western region in Inner Mongolia of China[J].Food Control,2011，22(5):767-774.

[4] 马凯,华威,龚平,等.顶空-固相微萃取方法分析4种发酵剂制作馒头中挥发性风味物质[J].食品科学,2014，35(16):128-132.

[5] 韩德权,孙庆申,李冰,等.复合发酵剂馒头和单一酵母馒头风味物质比较[J].食品科学,2012，33(2):240-242.

[6] 邓璀,李志建,刘长虹,等.顶空固相微萃取-气质联用分析酵子发酵面团挥发性风味物质[J].食品科技,2015，40(11):124-130.

[7] 布坎南 R E,吉本斯 N E.伯杰细菌鉴定手册[M].8版.北京:科学出版社,1984:729-805.

[8] 凌代文.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].北京:中国轻工业出版社,1999:58-60.

[9] CLEENWERCK I,VANDEMEULEBROECKE K,JANSSENS D,et al.Re-examination of the genusAcetobacter, with descriptions ofAcetobactercerevisiaesp. nov. andAcetobactermalorumsp. nov.[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2002,52:1 551-1 558.

[10] BJORKROTH K J,SCHILLINGER U,GEISEN R,et al.Taxonomic study ofWeissellaconfusaand description ofWeissellacibariasp. nov., detected in food and clinical samples[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology,2002,52(Pt1):141-148.

[11] 马凯，安云鹏，武会娟，等.一株优质传统馒头发酵酵素中乳酸菌CGMCC10264的分离与鉴定[J].食品安全质量检测学报,2016,7(9)：3 720-3 725.

[12] 李树高.影响馒头品质因素的探讨[J].粮食加工，2010,35(4):72-73.

[13] 刘同杰,李云,吴诗榕,等.传统酸面团中细菌与酵母菌的分离与鉴定[J].现代食品科技,2014，30(9):114-120，148.

[14] 姚国强,李慧,高鹏飞,等.乳酸菌在发酵酸面团中的研究与应用[J].中国食品学报,2013，13(3):163-170.

[15] 姚笛,孙大庆,李洪飞.东北粘豆包酸面团菌群多样性与自制酸面团中菌群变化规律的研究[J].现代食品科技,2015，31(5):90-95.

[16] ZHONG Guo-hua,HE Guo-qing.Predominant bacteria diversity in Chinese traditional sourdough[J].Journal of Food Science,2013,78(8): 1 218-1 223.

[17] LIU Tong-jie,LI Yun,CHEN Jian-cai,et al.Prevalence and diversity of lactic acid bacteria in Chinese traditional sourdough revealed by culture dependent and pyrosequencing approaches[J].LWT-Food Science and Technology,2016,68:91-97.

[18] COLLINS M D,SAMELIS J,METAXOPOULOS J,et al.Taxonomic studies on some leuconostoc-like organisms from fermented sausages: description of a new genusWeissellafor theLeuconostocparamesenteroidesgroup of species[J].Journal of Applied Bacteriology,1993,75(6):595-603.

[19] 王海娟,戴雨珂,潘渠.魏斯氏菌的研究现状[J].成都医学院学报,2014,9(6):747-750.

[20] 张红,胡青平.探究馒头用酸面团中自然发酵种的最初来源[J].食品工业科技,2013,34(17):185-188.

[21] ZHENG Xiao-wei,Tabrizi M R,NOUT M,et al.Daqu—a traditional Chinese liquor fermentation starter[J].Journal of the Institute of Brewing,2011,117(1):82-90.

[22] 尹艳丽,王金水,杨森,等.酸面团中的微生物群落及发酵过程中的代谢反应[J].食品工业科技,2014,35(19):368-372.

[23] 苏东海,李自红,苏东民,等.固相微萃取分析传统老酵头馒头挥发性物质[J].食品研究与开发,2011,32(6):94-97.

[24] LE V D,ZHENG Xiao-wei,CHEN jing-yu,et al.Characterization of volatile compounds in Fen-Daqua traditional Chinese liquor fermentation starter[J].Journal of the Institute of Brewing,2012,118(1):107-113.

[25] HEIMAN M L,GREENWAY F L.A healthy gastrointestinal microbiome is dependent on dietary diversity[J].Molecular Metabolism, 2016,5(5):317-320.

[26] 乜兰春,孙建设,陈华君,等.苹果不同品种果实香气物质研究[J].中国农业科学,2006,39(3):641-646.

[27] SALMINEN S,von Wright A.Lactic acid bacteria microbiology and functional aspects[M].New York: Marcel Dekker,1999:1-72.

[28] 丁必权,李秋鹏,季秀玲,等.高温短小芽孢杆菌及其产高温淀粉酶的初步研究[J].食品工业科技,2010,31(9):185-187:190.

[29] 刘青娥,钟仙龙.柑桔果醋酿造用菌种分离及其生产性能测定[J].广东农业科学,2015,42(20):80-85.

[30] THIELE C,GANZLE M G,VOGEL R F.Contribution of sourdough lactobacilli, yeast, and cereal enzymes to the generation of amino acids indough relevant for bread flavor[J].Cereal Chemistry,2002,79(1):45-51.

[31] LIU S Q.Practical implications of lactose and pyruvate metabolism bylactic acid bacteria in food and beverage fermentations[J]. International Journal of Food Microbiology,2003,83(2):115-131.