实时荧光定量PCR法定量微生物的条件及在鱼露和虾油微生物检测中的应用研究

王香君，李梦茹，段杉

1(四川省农业科学院蚕业研究所，四川 南充，637000)2(华南农业大学 食品学院，广东 广州，510642) 3(美国英狄士化学公司广州代表处，广东 广州，511430)

自然界中仅有不到1%的微生物可培养，因此传统的基于培养微生物的平板计数法无法对环境中微生物作出准确计数。目前已有多种不依赖培养的微生物计数方法出现，主要包括用流式细胞仪计数和通过测定微生物的核酸含量计数。采用流式细胞仪计数须先用荧光染料对微生物细胞染色，然后用流式细胞仪计数，该法需要昂贵的仪器，且不同大小和类型的细胞产生的信号不同，进样速度的差异、共存的杂质等产生的荧光信号等都会对计数结果产生影响。而通过测定环境中微生物的核酸(基因组DNA或RNA)浓度，以核酸浓度反映环境中微生物的数量的分子生物学方法，具有分析速度快、不依赖于培养等特点，克服了平板计数法的缺点。其中FQ-PCR技术通过PCR扩增细菌16S rDNA和真菌18S rDNA的基因序列来定量微生物，具有操作简便、灵敏度和特异性高等优点。

国内外已有多篇关于采用FQ-PCR法测定微生物数量的报道，例如CASTILLO等[1]用FQ-PCR对大肠杆菌(Escherichiacoli)DNA进行扩增，所得的标准曲线用于定量猪肉消化道中所有细菌，结果表明，FQ-PCR测出的细菌数比平板计数法高；YAMAMOTO等[2]和AL-GABR等[3]用FQ-PCR分别对土曲霉(Aspergillusterreus)和黑曲霉(Aspergillusniger)DNA进行扩增，所得的标准曲线分别用于定量空气和饮水中的所有真菌，发现用FQ-PCR得到的真菌数比平板计数法高1～2个数量级。然而，上述研究均未对所采用的引物的特异性、扩增效率等进行研究，其定量的准确性及所用引物和扩增条件是否能够普遍适用于各种环境条件下的微生物定量尚存疑问。WU等[4]归纳了多对扩增细菌16S rDNA和真菌18S rDNA通用引物，但这些细菌和真菌通用引物是否适用于FQ-PCR定量多种微生物尚待研究。

本研究选取多种常见的革兰氏阳性及阴性细菌、丝状真菌和酵母，以其DNA为模板，对国内外报道的几种常见细菌16S rDNA和真菌18S rDNA通用引物在FQ-PCR反应中的特异性、扩增效率进行评估，确定最恰当的引物，并优化扩增条件，在此基础上对发酵过程中鱼露和虾油的细菌和真菌数量的变化进行测定。

1 材料与方法

1.1 原料和菌种

1.1.1 原料

制作鱼露的原料来自阳江市海陵岛，包括6种新鲜小杂鱼，其所占质量百分比分别是双斑瓦鲽2.3%，短尾大眼鲷5.2%，翼红娘鱼5.4%，鲬6.3%，眶棘双边鱼80.8%，用塑料袋密封包装后存放在温度为-20 ℃的冰箱中。

制作虾油的原料南美白对虾(PenaeusvannameiBoone)虾头和虾壳由阳江市海达水产有限公司提供，用塑料袋密封包装后存放在温度为-20 ℃的冰箱中。

1.1.2 菌种

细菌：嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、假单胞菌(Pseudomonassp.)、不动杆菌(Acinetobactersp.)，菌株均来自华南农业大学食品学院微生物实验室。

真菌：酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、青霉(Penicilliumsp.)、曲霉(Aspergillussp.)，菌株均来自华南农业大学食品学院微生物实验室。

1.2 实验材料和仪器

核酸蛋白检测仪，德国Eppendorf公司；BioRad CFX96实时荧光定量PCR仪，BIO-RAD公司。

ZR Fungal/Bacterial DNA Kit，ZYMO RESEARCH；Bester®SybrGreen qPCR Mastermix，DBI®Bioscience；引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司(简称生工)合成(见表1和表2)。

1.3 研究方法

1.3.1 鱼露样品的制备

将小杂鱼于室温解冻后，与食盐按3∶1的质量比混匀，然后置于35 ℃的恒温箱中发酵。发酵过程中定期补加蒸发的水分以保持盐度恒定(25%，w/w)。定期取样，对其微生物进行计数。

表1 细菌通用引物Table 1 Bacterial universal primers

1.3.2 虾油样品的制备

将虾头虾壳于室温解冻后，用搅碎机绞碎，加入原料质量的5% NaCl混匀，装入烧杯中，再放于45 ℃水浴锅中，80 r/min保温自溶4 h。自溶完毕后，取出用200目尼龙纱布过滤，得自溶液并测定其盐度，再补加NaCl，使自溶液的NaCl质量分数达到25%，并将自溶液放入35 ℃培养箱中，待其发酵成熟后，进行微生物计数。

1.3.3 鱼露和虾油中微生物计数

分别采用平板计数法和FQ-PCR法对鱼露和虾油中微生物进行计数。

1.3.3.1 平板计数法

按GB 4789.2—2010方法稍作改进，在细菌培养基(PCA固体培养基)的基础上添加质量分数为0%和10%的NaCl，对能在0%和10%盐度下生存的细菌进行计数；在真菌培养基(PDA固体培养基)基础上添加0%和20% NaCl，对能在0%和20%盐度下生存的真菌进行计数，细菌和真菌数量的单位是lg CFU/mL。

1.3.3.2 FQ-PCR法

(1)各菌种DNA的提取：将嗜酸乳杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、假单胞菌、不动杆菌、酿酒酵母、青霉、曲霉分别扩大培养(嗜酸乳杆菌用MRS肉汤培养基培养，金黄色葡萄球菌用PCA液体培养基培养，假单胞菌用Pseudomonas液体培养基培养，大肠杆菌用LB液体培养基培养，不动杆菌用MM液体培养基培养，酿酒酵母用麦芽汁液体培养基培养，青霉用PDA液体培养基培养，曲霉用PDA液体培养基培养)，再用ZR Fungal/Bacterial DNA 提取试剂盒(操作方法见说明书)提取各菌种DNA，通过核酸蛋白检测仪测定DNA浓度，置-20 ℃保存备用。

(2)鱼露和虾油样品中微生物总DNA的提取：将发酵的鱼露和虾油在无菌条件下先用快速滤纸过滤掉粗颗粒后，分别用离心和过膜的方法分离菌体。离心条件为12 000 r/min离心3 min；过膜条件为用0.22 μm滤膜过滤菌体，然后用无菌水将滤膜上的菌体洗下来。用ZR Fungal/Bacterial DNA Kit分别提取上述2种方法获得的菌体总DNA。所有DNA样品均于-20 ℃保存备用。

(3)引物的选择：文献报道有多对通用引物用于FQ-PCR定量细菌和真菌数量，它们扩增不同的DNA片段，常用的细菌和真菌通用引物见表1和表2。

用表1细菌通用引物扩增相同的DNA模板(大肠杆菌)和表2真菌通用引物扩增相同的DNA模板(青霉)，并做2次独立重复实验。FQ-PCR反应体系为20 μL：SYBR Green QPCR Mix 10 μL、上下游引物(10 μmol/μL)各0.4 μL、DNA 模板2 μL、加双蒸水至20 μL。FQ-PCR反应参数：95 ℃预变性2 min；40个循环：95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，在延伸阶段收集荧光信号。DNA熔解曲线分析是从65 ℃以1 ℃/min的升温速度上升到95 ℃。同时设计阴性对照(无DNA模板)排除DNA污染，每个引物做3次平行。

(4)引物退火温度的优化：将(3)得到的最适的细菌和真菌通用引物进行FQ-PCR反应，DNA模板分别是大肠杆菌和青霉，将FQ-PCR扩增程序的退火温度分别设置为65、64.1、62.5、59.5、55.9、53、51和50 ℃，比较扩增效果，每个温度做3次平行，并做2次独立重复实验。

(5)单一细菌菌种和单一真菌菌种DNA的标准曲线：将嗜酸乳杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、假单胞菌、不动杆菌、酿酒酵母、青霉、曲霉的DNA分别用双蒸水稀释，使它们的DNA质量浓度均在20～100 ng/μL之间，再进行梯度稀释，选择合适的质量浓度梯度，用(3)和(4)得到的FQ-PCR最佳反应条件进行扩增，得到它们各自的标准曲线，每个标准点做3次平行，每条标曲做2次独立重复实验。

(6)混合细菌和混合真菌DNA的标准曲线：将嗜酸乳杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、假单胞菌、不动杆菌的DNA分别用双蒸水稀释，使它们的DNA质量浓度均在20～100 ng /μL之间，再各取DNA稀释液5 μL混匀，称为“混合细菌”；将酿酒酵母、青霉、曲霉的DNA也分别用双蒸水稀释，使它们的DNA质量浓度在20～100 ng /μL之间，再各取DNA稀释液10 μL混匀，称为“混合真菌”。并通过核酸蛋白检测仪测定DNA质量浓度后，将混合细菌和混合真菌分别进行梯度稀释，选择合适的质量浓度梯度，再用(3)和(4)得到的FQ-PCR反应条件进行扩增，得到它们各自的标准曲线。每个标准点做3次平行，每条标准曲线做2次独立重复实验。

(7)鱼露和虾油中细菌和真菌数量的测定：由(6)得到混合细菌和混合真菌DNA的标准曲线，根据鱼露和虾油中细菌和真菌DNA扩增曲线中的Cq值，再从标准曲线上查出DNA质量浓度。由于NADKARNI等[8]和SASS等[9]报道，1个细菌细胞相当于5 fg DNA；YAMAMOTO等[2]报道是1个真菌细胞相当于17.5 fg DNA，因此细菌和真菌从DNA转换成细胞数的换算数分别是5和17.5。FQ-PCR法测定鱼露和虾油中细菌和真菌数量的单位是lg个/mL。

1.4 数据分析

测定和分析结果采用SPSS 16.0和Excel进行数据处理，结果采取均值±标准差形式。p<0.05认为具有显著差异。

2 结果与讨论

2.1 细菌和真菌FQ-PCR定量条件的确定

2.1.1 引物的选择

用表1细菌通用引物扩增相同的DNA模板(大肠杆菌)和表2真菌通用引物扩增相同的DNA模板(青霉)，结果见图1和图2。

以不同引物扩增细菌16S rDNA和真菌18S rDNA的不同区域，不合适的引物会出现非特异性扩增，导致FQ-PCR定量不准确。因此引物的选择标准是扩增特异性高，不产生非特异性扩增，不形成引物二聚体，同时要求得到的扩增曲线光滑平稳，荧光吸收图谱的S形曲线形状完好，以出现最小Cq值和最高荧光值为最佳。引物的特异性可通过分析扩增产物的熔解曲线确定，特异性扩增的熔解曲线只能有单峰，如出现明显双峰甚至多峰则属非特异性扩增；而阴性对照要求起峰Cq>35个循环[8]。

图1 细菌通用引物的扩增曲线和熔解曲线Fig.1 Amplification curve and melting curve analysis of PCR products of bacterial universal primers

图2 真菌通用引物的的扩增曲线和熔解曲线Fig.2 Amplification curve and melting curve analysis of PCR products of fungal universal primers

由图1可知，引物P11P-P13P和338F-518R的扩增曲线的平台期不完整；引物63F-335R和515F-806R比较，63F-335R的Cq值较小和荧光值较高，扩增曲线呈平稳光滑的S形，且熔解曲线只有单峰，CASTILLO等[1]选择引物63F-335R用FQ-PCR成功定量了猪肉消化道中的细菌，因此选用63F-335R作为FQ-PCR测定细菌数量的引物。由图2可知，真菌引物NS1-NS2和NS5-NS6出现明显双峰，引物P1-P2和0817F-1536R出现微弱双峰，而引物0817F-1196R熔解曲线只有单峰，同时扩增曲线也是呈平稳光滑的S形完整曲线，扩增效果较好，因此选用0817F-1196R为FQ-PCR定量测定真菌数量的引物。

2.1.2 引物的退火温度

为确定引物63F-335R和0817F-1196R的退火温度，由生工合成的表1和表2中引物的参考熔解温度Tm范围为55～70 ℃，而文献报道引物的退火温度要低于熔解温度Tm5 ℃左右，因此将FQ-PCR扩增程序的退火温度分别设置为65、64.1、62.5、59.5、55.9、53、51和50 ℃，扩增结果见图3和图4。

图3 引物63F-335R温度梯度的扩增曲线和熔解曲线Fig.3 Amplification curve and melting curve analysis of annealing temperature produced by FQ-PCR with primer 63F-335R

图4 引物0817F-1196R温度梯度的扩增曲线和熔解曲线Fig.4 Amplification curve and melting curve analysis of annealing temperature produced by FQ-PCR with primer 0817F-1196R

引物退火温度以引物得到的熔解曲线中熔解峰有最高的峰值、最窄的峰型以及扩增曲线有最小的Cq值为最佳。图3显示，引物63F-335R在59.5 ℃得到的熔解峰峰值较高、峰型较窄，同时通过结合CASTILLO[1]关于引物63F-335R的退火温度为60 ℃的报道，确定引物63F-335R的退火温度为60 ℃。报道中显示的引物0817F-1196R的退火温度有所不同，退火温度范围为48～58 ℃。图4显示引物0817F-1196R在59.5 ℃得到的熔解峰峰值较高、峰型较窄、Cq值最小，由于适当提高退火温度有利于提高FQ-PCR反应的特异性，因此选择与59.5 ℃最接近的60 ℃为引物0817F-1196R的退火温度。

2.2 细菌和真菌的FQ-PCR标准曲线

线性扩增要符合如下标准：FQ-PCR标准曲线的决定系数R2>0.98；PCR扩增效率(E)在90%～120%范围内[10-11]。RODRIGUEZ等[12]报道，FQ-PCR标准曲线的决定系数R2越接近1、扩增效率越接近100%、斜率越接近-3.322，结果可信度越高。

2.2.1 单一细菌菌种DNA的标准曲线

采用引物63F-335R和60 ℃退火温度分别对嗜酸乳杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、假单胞菌、不动杆菌的DNA进行扩增，获得各自的标准曲线如图5所示。

图5 几种细菌菌种DNA扩增的标准曲线Fig.5 Standard curves constructed after FQ-PCR amplification of serial dilutions of DNA of many bacterial strains

图5显示，每种细菌DNA的扩增符合线性扩增标准，标准曲线都有良好的线性关系，实验重复性好，说明引物63F-335R适合对细菌进行FQ-PCR定量分析。

2.2.2 单一真菌菌种DNA的标准曲线

采用引物0817F-1196R和60 ℃退火温度分别扩增酿酒酵母、青霉、曲霉的DNA，获得各自的标准曲线见图6。

图6 几种真菌菌种DNA扩增的标准曲线Fig.6 Standard curves constructed after FQ-PCR amplification of serial dilutions of DNA of many fungal strains

图6显示，酿酒酵母、青霉、曲霉的DNA扩增效果良好综合图5和图6结果显示，细菌通用引物63F-335R和真菌通用引物0817F-1196R对单一菌种的扩增效果较好。

2.2.3 混合细菌和混合真菌DNA的标准曲线

将混合细菌和混合真菌DNA分别进行FQ-PCR扩增，得到它们的标准曲线，结果见图7和图8。

图7 混合细菌DNA的扩增曲线和标准曲线Fig.7 Amplification curve and standard curve constructed after FQ-PCR amplification of serial dilutions of mixed bacterial DNA注：标准曲线中混合细菌DNA浓度从大到小分别为 7×107、7×106、7×105、7×104、7×103 fg/μL。

图7和图8显示，混合细菌和混合真菌DNA的扩增效果良好，得到的标准曲线都有很好的线性关系，没有非特异扩增。

图8 混合真菌DNA的扩增曲线和标准曲线Fig.8 Amplification curve and standard curve constructed after FQ-PCR amplification of serial dilutions of mixed fungal DNA 注：标准曲线中混合真菌DNA质量浓度从大到小分别为9×105、9×104、9×103、9×102、9×101 fg/μL。

由图5和图6可知，不同的细菌和真菌DNA扩增的标准曲线的决定系数R2、扩增效率和斜率都有所差异，通过SPSS分析可知，本文G+中嗜酸乳杆菌和金黄色葡萄球菌DNA扩增的标准曲线的斜率与G-(大肠杆菌、假单胞菌、不动杆菌)均有显著差异(p<0.05)，而G+和G-组内的细菌之间没有显著差异，真菌中酵母与霉菌(青霉、曲霉)均存在显著差异(p<0.05)。鱼露和虾油等自然发酵产品中多种细菌和真菌共存，且在发酵不同阶段各种细菌、真菌的组成和数量会有波动。以仅含有一种细菌或真菌的DNA为模板扩增的标准曲线为标准可能比用混菌的DNA为模板的要低，而用混合菌株做标准曲线更趋近于真实情况，而本研究混合细菌和混合真菌即使在低浓度模板扩增都能得到良好的线性关系，试验重复性好，灵敏度高，因此本文选择混合细菌和混合真菌DNA扩增的标准曲线去测定鱼露和虾油中细菌和真菌数量。细菌标准曲线为y=-3.155x+33.220、R2=0.999；真菌标准曲线为y=-3.395x+32.671、R2=0.998。

本研究结果表明并非所有细菌和真菌通用引物都可用于FQ-PCR定量微生物，不合适的引物会出现非特异性扩增、扩增曲线不完整等结果，影响定量。而细菌通用引物63F-335R和真菌通用引物0817F-1196R无论对单一菌种或混合菌种，所得FQ-PCR标准曲线决定系数R2均>0.98，扩增效率E均在90%～120%范围内，均符合线性扩增标准，可用于FQ-PCR定量。因此可以将FQ-PCR用于鱼露、虾油中微生物的定量研究。

2.3 FQ-PCR计数法及平板计数法的结果比较

采用FQ-PCR法用上述条件测定了虾油中的细菌数量以及鱼露发酵过程中细菌和真菌数量的变化，同时与平板计数法的结果进行了比较，结果见图9。

图9 平板计数法和FQ-PCR法定量鱼露和虾油中细菌和真菌的结果比较以及鱼露发酵过程中细菌和真菌数量的变化Fig.9 Comparison of the results of bacterial and fungal populations in fish sauce and shrimp sauce determined by plate count method and FQ-PCR method, and detection of the change of bacterial and fungal populations in fish sauce during fermentation

图9显示，经 SPSS软件方差分析，FQ-PCR法和平板计数法比较，有极显著性差异(p<0.01)，FQ-PCR法比平板计数法检测出的鱼露和虾油的细菌总数和真菌总数高1～2个数量级，这与NADKARNI[8]和YAMAMOTO[2]的研究结果一致。用过膜方法和离心方法分离鱼露和虾油中细菌，结果显示两种方法分离的细菌数量有显著性差异(p<0.05)，且过膜方法的结果略高，推测可能是由于鱼露及虾油的盐分较高，密度较大，离心不能将微生物完全沉淀下来，用过膜的方法得到的结果较准确。虾油中细菌的平板计数结果显示，10%盐度培养基上的细菌数比0%盐度培养基的低1～2个数量级，因此没有将10%盐度的结果列出。在鱼露的真菌培养中，在0%盐度PDA培养基上基本无真菌生长，在20%盐度的培养基上经过一周左右时间有极少数真菌生长，因此没有将鱼露真菌培养的结果列出。

在鱼露发酵过程中，用FQ-PCR方法检测到鱼露发酵过程中真菌数量虽略有增加，但一直在50 个/mL以下；而在平板计数法中，0%盐度PDA培养基上基本无真菌生长，在20%盐度的培养基上经过1周左右时间有极少数真菌生长，推测可能是鱼露含有25%的盐度，在这种环境下生存的真菌难以在无盐的培养基上生长。国外研究在鱼露发酵过程中用平板计数法也几乎检测不到真菌，与本研究的结果一致[13-14]。用FQ-PCR方法检测到鱼露发酵过程中细菌数量在3.16×104～3.16×105个/mL范围内变动，数量远高于真菌数。这说明在鱼露发酵过程中真菌作用较小。许多文献报道一些耐盐或嗜盐的乳酸菌是发酵鱼产品中的优势菌群。

FQ-PCR的结果能很好地反映鱼露发酵过程中细菌数量的变化规律，鱼露发酵初期细菌数较高，可能是鱼体表面及胃肠道、鱼鳃等部位有一些不耐盐的微生物尚未死亡，但是随着发酵时间的延长，这些不耐盐的微生物逐渐死亡，而在发酵过程中耐盐和嗜盐微生物逐渐成为优势菌，后期逐渐趋于稳定。

3 结论

研究表明，FQ-PCR法可以有效定量鱼露和虾油中细菌和真菌数量，且测得的数据比平板计数法高1～2个数量级。

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