豉香型白酒制曲原料中肉桂叶游离态挥发性成分

何张兰，范文来*，徐岩，何松贵，刘兴益

1(教育部工业生物技术重点实验室，江南大学 生物工程学院，酿造微生物与应用酶学研究室，江苏 无锡，214122) 2(广东省九江酒厂有限公司技术中心，广东 佛山，528203)

肉桂叶，为樟科植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl)的干燥叶，呈椭圆形至近披针形，具有特异香气，叶柄味较浓。肉桂主要种植于我国南方如广东、云南、福建等地[1]，是豉香型白酒制曲过程中重要添加物(100 g酒饼中添加约1 g肉桂叶)。添加肉桂叶对酒曲微生物生长繁殖起到一定促进作用[2-4]，并影响成品酒的风味[5]。

对肉桂挥发性成分研究多集中于肉桂油，即将肉桂叶或肉桂皮采用水蒸气蒸馏、超临界萃取、固相微萃取等方法萃取得到其精油，再结合气相色谱-质谱仪(gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)对精油化学成分进行分析。肉桂精油中含量较多的是肉桂醛(84.22%)、2-甲氧基肉桂醛(7.07%)、香豆素(3.82%)、苯甲醛(1.1%)、乙酸肉桂酯(3.92%)等[6]，然而大量的研究均为半定量[6-10]。

制曲原料中添加的肉桂叶是风干后的树叶，对其挥发性成分的研究较少。为探索肉桂叶对制曲以及豉香型白酒风味的影响，本研究以广东某豉香型酒厂制曲生产时使用的肉桂叶为原料，采用模拟制曲加水浸泡后，再采用液液萃取(liquid-liquid extraction，LLE)方法萃取挥发性成分，结合GC-MS对其挥发性成分进行鉴定与定量，以期发现肉桂叶中的重要挥发性成分，为后续制曲、酿酒发酵、蒸馏以及贮存过程的研究提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品与试剂

肉桂叶样品：由广东省九江酒厂有限公司提供。

试剂：无水乙醚、无水氯化钠、无水硫酸钠(分析纯)，上海国药集团；己酸甲酯(99%，内标)、无水乙醇、表中全定量的化合物(色谱纯)，美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 仪器与设备

GC-6890N-MSD 5975，美国Agilent公司；N-EVAP111型氮吹仪，美国Organomation公司；5810R离心机，德国Eppendorf公司；超纯水仪，美国Millipore公司。

1.3 实验方法

1.3.1 挥发性化合物提取

[11]的实验方法。取8 g干燥的肉桂叶，液氮冷却后立即磨碎，后用150 mL超纯水浸泡，室温、黑暗条件浸泡过夜。过滤，滤液加无水氯化钠饱和，用60 mL重蒸乙醚液液萃取3次(每次20 mL)，合并有机相，离心去乳化，取上清液加无水硫酸钠干燥过夜，氮吹，浓缩至250 μL，进行GC-MS分析。

1.3.2 GC-MS条件

色谱柱：FFAP极性柱(60 m×0.25mm×0.25 μm)，进样口温度250 ℃；升温程序：初温50 ℃，保持2 min，以6 ℃/min升温至230 ℃，保持45 min；载气(He)，流速2 mL/min；进样1 μL，不分流进样。

质谱条件：离子源230 ℃，EI电离源，电子轰击能量70 eV，扫描范围为35～350 amu。

1.3.3 化合物鉴定与定量

挥发性化合物定性通过质谱库检索与标准品保留指数(RI)比对鉴定，没有标准品的化合物通过与NIST05a.L数据库(Agilent Technologies Inc.)中标准谱图以及文献中报道的保留指数(RIL)进行比对鉴定，其中RI计算方法参考文献报道[12]。

定量采用液液萃取的前处理方法。过滤后，加入内标己酸甲酯(终质量浓度16.115 mg/L)后进行液液萃取，选择5个不同的批次，每批次测定1次。采用选择特征离子(SIM)方法定量。

在重蒸后的乙醚溶液中加入待测物标准品的贮备液，进行梯度稀释后，加入内标己酸甲酯(终质量浓度16.115 mg/L)，其他条件同样品的检测条件。采用SIM方法计算各化合物峰面积，以各化合物与内标的峰面积之比为横坐标，质量浓度之比为纵坐标绘制标准曲线。

无标准品半定量化合物质量浓度按公式(1)计算：

(1)

式中：C，待测化合物质量浓度，μg/g干重；S，待测化

合物峰面积；S内，内标物峰面积；C内，内标化合物终质量浓度，μg/L。

2 结果与讨论

2.1 挥发性化合物鉴定与定量

经GC-MS分析，在肉桂叶水浸提液中检测到45种挥发性化合物，包括25种芳香类、8种酚类、6种萜烯类、2种有机酸类、3种呋喃类以及1种吡喃类，其中31种化合物使用标准品确认，14种化合物为临时性鉴定。与桂叶油早期研究结果相比[1, 6, 8-9]，新检测到的成分有苯乙醛、1,2-二甲氧基苯、苯甲醇、己酸、2-甲氧基苯甲醇、愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚、丁香醇、氢化肉桂酸内酯、苯甲酸、香兰素、2-甲氧基苯甲酸、2-羟基苯乙醇等。

对肉桂叶样品中的31种挥发性成分绘制标准曲线进行全定量分析，线性关系良好，R2范围在0.904 5～0.999 7，回收率在82%～114%，符合定量要求。

2.2 芳香类化合物

芳香类化合物是肉桂叶中种类最多的、含量最高的游离态挥发性化合物，总含量达6.01 mg/g干重(表1)。共检测出25种，以芳香醇、芳香醛以及芳香酸为主；首次检测到的化合物有苯乙醛、1,2-二甲氧基苯、苯甲醇、2-甲氧基苯甲醇、苯甲酸、2-甲氧基苯甲酸、2-羟基苯乙醇等。

表1 肉桂叶中芳香类化合物含量Table 1 The concentrations of aromatic compounds in Cinnamomum cassia Presl leaf

注：a：通过质谱定性，临时性鉴定的化合物，半定量；b：单位为mg/g干重。

芳香醛类主要检测到苯甲醛、水杨醛、苯乙醛、苯丙醛、反-肉桂醛、2-甲氧基苯甲醛、2-甲氧基肉桂醛(临时性鉴定)；芳香醇类主要检测到苯甲醇、2-苯乙醇、肉桂醇、2-羟基苯乙醇、2-甲氧基苯甲醇、α-甲基苯乙醇(临时性鉴定)、3,5-二甲基苯甲醇(临时性鉴定)；芳香酸类主要检测到苯甲酸以及2-甲氧基苯甲酸。大曲挥发性成分研究结果表明，在所有香型大曲中，豉香型大曲中总芳香族含量最高[13]。

芳香类化合物中反-肉桂醛含量高达3.71 mg/g干重，与早期桂叶油研究相比结果类似[6, 9]；其次是2-苯乙醇，含量为386 μg/g干重。

反-肉桂醛具有典型的肉桂香气[16]，已经在豉香型白酒中检测到，含量471 μg/L[5]，是豉香型白酒呈香化合物之一，而在其他香型白酒中报道极少。推测豉香型白酒中反-肉桂醛可能来源于制曲原料肉桂叶。研究发现，在酒饼制作过程中，反-肉桂醛对酒曲微生物繁殖有一定促进作用，能诱导酿酒酵母形成，并抑制一些曲霉活性[2-4]。

2-苯乙醇具有典型甜香、玫瑰花香和蜂蜜香[17]，早期桂叶油研究中已经检测到[7, 18]。2-苯乙醇存在于多种香型白酒中，如茅台酒中含量53.2 mg/L[13]，汾酒30.0 mg/L[12]，老白干 32.9 mg/L[12]，西凤酒45.0 mg/L[12]，景芝酒中1.18 mg/L[19]，豉香型酒中含量高达127 mg/L[5]，远高于其他香型白酒。推测高浓度2-苯乙醇主要来源：一是酿酒生产过程中L-苯丙氨酸通过埃尔利希途径(Ehrlich path)生成2-苯乙醇[20]；另外一部分可能来源于曲的迁移。

茴香脑，呈茴香香气[21]。在早期文献中曾检测到[22]，含量4.08 μg/g干重。该物质能氧化生成茴香醛[23]，而茴香醛在药香型白酒中已经检测到[21]，推测白酒中的茴香醛很有可能是原料桂叶中的茴香脑经发酵、蒸馏过程中的氧化形成。

2.3 酚类化合物

在肉桂叶中共检测到8种酚类化合物(表 2)，包括首次检测到的愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚、丁香醇、香兰素、丁香醛。

酚类化合物总含量达到402 μg/g干重，其中含量最高的为首次检测到的丁香醛(176 μg/g干重)，其次为丁香醇(57.3μg/g干重)与丁香酚(56.8 μg/g干重)。丁香酚已经在桂叶油中检测到，其含量占肉桂油的0.677%[8]。

酚类化合物大多数具有烟熏味，如愈创木酚、丁香醇等。而香兰素则赋予肉桂叶香草气味[11]。

表2 肉桂叶中酚类化合物含量Table 2 The concentrations of phenolic compounds of Cinnamomum cassia Presl leaf

注：a：临时性鉴定的化合物，半定量方法定量，通过质谱定性。

2.4 萜烯类化合物

从肉桂叶中共检测到6种萜烯类化合物(表 3)，总含量57.9 μg/g干重，包括2-茨醇与β-紫罗兰酮(临时性鉴定)及其衍生物(临时性鉴定)。萜烯类化合物广泛存在于植物中，这类化合物具有抗癌症、抗病毒以及抗炎症等作用[14]。

2-茨醇，又称龙脑，呈樟脑、墨水香气[17]；在肉桂叶中含量为5.52μg/g干重，在桂叶油中含量0.134%[8]。

2.5 其他化合物

从肉桂叶中还检测到2种有机酸化合物、3种呋喃类化合物以及1种吡喃类化合物(表4)。其中己酸、氢化肉桂酸内酯均为首次检测到的挥发性化合物[1, 6, 8-9]。

2种有机酸类化合物包括乙酸和己酸，总含量38.7 μg/g干重，在早期肉桂油的研究中曾检测到乙酸[9]。

3种呋喃类化合物包括2,3-二氢苯并呋喃以及氢化肉桂酸内酯以及2-甲基苯并呋喃(临时性鉴定)。

1个吡喃类化合物为香豆素。香豆素含量达到2.60 mg/g 干重，是本研究中检测到含量仅次于反-肉桂醛的游离态挥发性化合物。香豆素存在于桂叶油中[6]。该化合物具有甜香、椰子香的风味特征[17]。

表3 肉桂叶中萜烯类化合物含量Table 3 The concentrations of terpenes of Cinnmaomum cassia Presl leaf

注：a：临时性鉴定的化合物，半定量方法定量，通过质谱定性；

表4 肉桂叶中其他化合物含量Table 4 The concentrations of other compounds of Cinnmaomum cassia Presl leaf

注：a：临时性鉴定的化合物，半定量，通过质谱定性；b：单位为mg/g干重。

3 结论

肉桂叶采用水溶液浸泡，LLE方法萃取挥发性成分，经GC-MS分析共检测出45种挥发性化合物，包括25种芳香类、8种酚类、6种萜烯类、2种有机酸类、3种呋喃类以及1种吡喃类，首次检测到化合物有苯乙醛、1,2-二甲氧基苯、苯甲醇、己酸、2-甲氧基苯甲醇、愈创木酚、4-乙烯基愈创木酚、丁香醇、氢化肉桂酸内酯、苯甲酸、香兰素、2-甲氧基苯甲酸、2-羟基苯乙醇等。芳香族化合物在肉桂叶中种类最多，含量较高。肉桂叶中含量最高的化合物是反-肉桂醛(mg/g以上)，接着是香豆素(mg/g以上)，再次是μg/g级的2-苯乙醇、丁香醛、氢化肉桂酸内酯、苯甲醛等。推测反-肉桂醛是肉桂叶的主要香气成分，并为豉香型白酒提供重要香气。

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