蓖麻RcDELLA基因的克隆及序列分析

李 威，李国瑞,2,3,4，黄凤兰,2,3,4，丛安琪，李晓晨，白英俊，李孟建，陈永胜，2，3，4

(1.内蒙古民族大学，内蒙古 通辽 028000;2.内蒙古自治区高校蓖麻产业工程技术研究中心，内蒙古 通辽 028000;3.内蒙古自治区蓖麻育种重点实验室，内蒙古 通辽 028000;4.内蒙古自治区蓖麻产业协同创新培育中心，内蒙古 通辽 028000)

蓖麻(RicinuscommunisL.)是大戟科蓖麻属植物，蓖麻油广泛应用于国防、农业、化工、医药和机械制造等方面，具有重要的商业价值[1]。我国是世界第二大蓖麻籽生产国，北起黑龙江，南至海南岛均有种植[2]。与主要农作物相比，蓖麻产量相对低，这极大地限制了蓖麻产业的发展。矮秆蓖麻植株较矮，营养体小(80～150 cm)，占据空间小，水分、养分运输的距离相对较短，经济系数相对高，提高了养分、水分的利用率，增强了其抗倒伏、抗旱性和耐瘠薄能力，若遇强降雨、大风等恶劣天气，矮秆蓖麻防灾抗灾能力大大增强，提高了瘠薄地、边际地的利用效率，进而提高蓖麻产量，所以蓖麻矮化育种研究成为热点。

赤霉素(GA)是一类调节植物生长的重要激素，主要在植物的顶端幼嫩部位合成，如茎尖和根尖，在生长中的种子和果实中也大量合成。GA在种子萌发、茎伸长、子叶伸展、下胚轴伸长以及成花诱导等生命活动中发挥重要作用。DELLA蛋白是GA信号转导途径的关键调控元件。它的生物学功能是负向调节GA 信号途径，抑制植物生长发育[3-9]。DELLA蛋白的氨基酸序列中，N端的同源性不高，但均具有DELLA 和TVHYNP 2个保守的酸性结构域。一般认为，这2个结构域的突变影响蛋白与赤霉素受体GID1的结合能力[10-11]。随着对DELLA蛋白研究的深入，DELLA基因已经在多种植物被克隆和表达分析，水稻中的SLR1基因、小麦中的RHT-1基因、玉米中的D8基因[12]、大麦中的SLN1基因、甜樱桃中的PaGAI基因[13]、棉花中的GhGAI3、GhGAI4、GhGAI2b、GhGAI4b基因[14-17]以及拟南芥中的GAI、RGA、RGL1、RGL2、RGL3。Thomas等[18]验证了DELLA蛋白和GA调控拟南芥种子萌发和花的发育。Hou等[19]以野生型和della缺失突变体拟南芥为材料，发现在没有GA存在的条件下，DELLA结合JAZ，释放MYC2促进下游JA效应基因的表达。Boccaccini等[20]发现DOF蛋白的DAG1和DELLA蛋白的GAI共同作用,负向调控AtGA3oxl基因，进而调控拟南芥的生长。Hussain等[21]研究发现，DELLA与两HD-ZIP的转录因子可以调节GA信号转导，抑制拟南芥生长。大量试验证明DELLA过表达植株可以明显抑制GA的作用，显著降低株高。本试验通过克隆蓖麻DELLA基因完整阅读框并对其进行生物学信息分析，为进一步研究DELLA蛋白对蓖麻的矮化作用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 植物材料 蓖麻2129品系由内蒙古通辽市农业科学研究院提供，取自2129植株六叶期茎尖，经液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱备用。

1.1.2 试剂及菌株 Pyrobest DNA 聚合酶、T4DNA连接酶、DNA Marker(购自宝生物有限公司)；DH5α大肠杆菌感受态细胞、pMD-18T载体(购自北京庄盟国际科技有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 总RNA的提取，反转录cDNA 采用TaKaRa的RNA提取试剂盒提取蓖麻2129生长六叶期茎尖的总RNA，备用。参照TaKaRa公司的cDNA 逆转录试剂盒说明书进行逆转录。

1.2.2DELLA基因的克隆 根据NCBI上公布的蓖麻DELLA的全长序列，设计5′端引物primer2：5′-ATGAAAAGAGAACACCAAGAAAGCAAA

GG-3′，3′端引物primer1：5′-CTTTGAATCGCTG

AGTTGCCAAG-3′(图1)。以蓖麻2129六叶期茎尖的总RNA逆转录cDNA为模板进行扩增。扩增体系：cDNA 100 ng，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP(2.5 mmol/L)3 μL，上下游引物各1 μL，Pyrobest DNA 聚合酶2.5 μL，总体积50 μL。PCR 程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 变性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃ 延伸2 min，28 个循环。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，然后用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的条带，连接pMD-18T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，进行蓝白斑筛选，挑取白色单菌落，放大培养后将阳性克隆送至GENERAY公司测序。

1.2.3DELLA基因的生物信息学分析 克隆得到的DELLA基因序列，利用在线工具ProtParam程序(http：//web.Expasy.org/protparam/)预测蛋白质的分子式、分子量、等电点和不稳定系数等；TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)对蛋白质跨膜型进行预测；用SignalP(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)程序进行蛋白质信号肽分析；用Predict-protein(http://www.Predictprotein.org)程序对蛋白质二级结构进行预测；利用Phyre 2 软件(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2)对蓖麻RcDELLA基因的三级结构进行预测；在线工具ProtFun 2.2 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun/)进行了功能预测分析；采用Interproscan ( http: //www.Ebi.Ac.uk /interpro /scan.html)软件对RcDELLA同源序列进行保守序列和结构域分析。

The full-length sequence of DELLA gene of castor 2 146 bp

2 结果与分析

2.1 蓖麻总RNA的提取

由图2可知，利用RNA提取试剂盒法提取蓖麻六叶期茎尖的总RNA，经电泳检测后28S和18S核糖体RNA亮度接近2∶1，且没有DNA 污染，紫外分光光度计检测结果显示OD260/280为1.95，说明提取的蓖麻茎尖总RNA纯度高，可以用于后续试验。

图2 蓖麻总RNA提取结果Fig.2 Extraction of total RNA from castor

2.2 RcDELLA基因及编码的氨基酸特征分析

在已知序列的基础上对目的基因进行扩增，扩增获得DELLA完整开放阅读框全长为1 701 bp(图3)，编码567个氨基酸，其中亮氨酸(Leu)最多，有61个，占10.8%；其次是丝氨酸(Ser)有57个，占10.1%；丙氨酸(Ala)有50个，占8.8%；谷氨酸(Glu)40个，占7.1%。根据ExPASyProtParam预测：RcDELLA基因编码的蛋白分子式为C2744H4296N764O860S25，分子量为62 550.40 ku，等电点为5.14，不稳定系数为49.86，被归类为不稳定蛋白，GRAVY为-0.847，为亲水性蛋白。RcDELLA中带负电荷的残留物总数为70，带正电荷的残留物总数为47，半衰期为30 h。利用SignalP进行蛋白质信号肽分析，发现RcDELLA序列含有信号肽，为分泌蛋白。利用 TMHMM Server v. 2.0 网站对RcDELLA的跨膜结构域进行分析，结果表明RcDELLA蛋白质无跨膜结构域，这与理化性质分析此蛋白为亲水性蛋白的结果相一致。

M．DL2000 Marker; 1．PCR扩增产物。M．DL2000 Marker; 1．PCR product.

2.3 DELLA蛋白的二级结构和三级结构预测

利用Predict-protein对DELLA蛋白二级结构进行预测，其中α-螺旋占40.4%，β-折叠占8.6%，无规则卷曲占51.0%。利用Phyre 2网站对蓖麻DELLA基因编码的蛋白质进行三级结构预测，结果见图4。

图4 RcDELLA蛋白的三级结构预测Fig.4 Prediction of the tertiary structure of RcDELLA

2.4 RcDELLA同源性和系统进化分析

利用DNAMAN软件对蓖麻RcDELLA与柑橘(Citrussinensis，XP_006482132.1)、木本棉(Gossypiumarboreum,XP_017606442.1)、巴西橡胶树(Heveabrasiliensis,ALG02536.1)、麻疯树(Jatrophacurcas,XP_012077792.2)、核桃(Juglansregia,XP_018816848.1)、苹果(Malusdomestica,NP_001315916.1 )、芍药(Paeonialactiflora,ANA05341.1)、胡杨(Populuseuphratica,XP_011002785.1 )、桃(Prunuspersica,XP_007214956.1 )、中国李(Prunussalicina,AQQ12221.1 )、葡萄(Vitisvinifera,XP_002266267.1 )、金丝小枣(Ziziphusjujuba,XP_015872191.1 )12种DELLA氨基酸序列进行同源性比对(图5)，其中与巴西橡胶树相似性为73.87%，与柑橘相似性为74.49%，13个氨基酸序列N端的保守性不高，但均具有DELLA 和TVHYNP 2个保守的酸性结构域。

利用MEGA 7.0 软件构建系统进化树(图6)，结果表明，RcDELLA先与大戟科巴西橡胶树(ALG02536.1)和麻疯树(XP_012077792.2)形成分支，结果符合进化关系，与同源性比对结果一致。

2.5 RcDELLA蛋白的功能预测分析及保守序列和结构域分析

利用在线工具ProtFun 2.2 Server进行了功能预测分析，发现此基因的主要功能是转运结合(表1)。

向右箭头为DELLA保守结构域；向左箭头为TVHYNP保守结构域；五角星为蓖麻DELLA氨基酸序列。Ps_DELLA.中国李；Hb_DELLA.巴西橡胶树；Ga_DELLA.木本棉；Cs_DELLA.柑橘；Jr_DELLA.核桃；Pp_DELLA.桃；Pe_DELLA.胡杨；Pl_DELLA.芍药；Md_DELLA.苹果；Vv_DELLA.葡萄；Rc_DELLA.蓖麻；Zj_DELLA.金丝小枣；Jc_DELLA.麻疯树。

The right arrow is the conservative domain of the DELLA; the left arrow is the TVHYNP conservative domain；five-pointed star is a castor DELLA amino acid sequence；Ps_DELLA.Prunussalicina;Hb_DELLA.Heveabrasiliensis; Ga_DELLA.Gossypiumarboretum; Cs_DELLA.Citrussinensis; Jr_DELLA.Juglansregia; Pp_DELLA.Prunuspersica; Pe_DELLA.Populuseuphratica; Pl_DELLA.Paeonialactiflora; Md_DELLA.Malusdomestica; Vv_DELLA.Vitisvinifera; Rc_DELLA.Ricinuscommunis; Zj_DELLA.Ziziphusjujube; Jc_DELLA.Jatrophacurcas.

图5不同植物DELLA基因氨基酸序列同源性比较
Fig.5AlignmentofdeducedaminoacidsequencesofDELLAgenesofdifferentplants

利用Interproscan对RcDELLA同源序列进行保守序列和结构域分析(图7)，结构域预测显示RcDELLA具有一个转录因子DELLA域和2个转录因子GRAS域，进一步证实该基因具有DELLA蛋白结构。

3 讨论

赤霉素(GA)是一类调节植物生长的重要激素，调控植物生长发育的各个阶段，包括种子的发芽、茎秆的伸长、开花时间、花与果实的成熟等许多不同的发育过程。DELLA蛋白负向调节GA 信号途径，抑制植株生长发育。当DELLA蛋白上的GA信号感知区接收到GA信号后, 这种蛋白的阻遏作用被解除，植株表现出瘦高的表型,但当DELLA结构发生变化或者过表达则不能降解或降解完全，从而使植株表现出矮化表型[22-23]。

图6 RcDELLA的进化树分析Fig.6 Molecular phylogenic tree of RcDELLA from plants

功能Function可能性Possibility可能率Odds生物合成的辅因子Cofactorsofbiosynthesis0.0380.530细胞外被膜Capsuleofextracellular0.0320.523细胞加工Cellprocessing0.0270.373中间代谢Intermediatemetabolism0.0410.658能量代谢Energymetabolism0.1121.242脂肪酸代谢Fattyacidmetabolism0.0171.303嘌呤嘧啶Purinepyrimidine0.0640.265转运结合Transportcombined0.8342.033

图7 RcDELLA保守序列和结构域分析Fig.7 Analysis of conserved sequence and domain of RcDELLA

本试验克隆得到了1 701 bp的蓖麻RcDELLA蛋白基因cDNA 完整的开放阅读框序列，推测其可编码567 个氨基酸的多肽。蓖麻RcDELLA蛋白含有典型的DELLA和TVHYNP 2个保守的酸性结构域，这与NCBI上公布的其他植物的DELLA蛋白序列具有高度的同源性。通过理化性质、跨膜分析、信号肽预测和结构域分析显示:RcDELLA序列含有信号肽，为分泌蛋白，无跨膜结构域，这与理化性质分析此蛋白为亲水性蛋白结果相一致。功能预测分析表明，该蛋白的主要作用是转运结合。随着对DELLA蛋白研究的深入，它在植物生长发育过程的作用也受到越来越多的关注，利用分子生物学方法对蓖麻的RcDELLA基因进行克隆和分析，为进一步对蓖麻DELLA蛋白在植物体内作用机理的研究提供理论依据。目前，水稻、玉米、小麦等作物均已通过分子手段培育出了矮化的新品种，但在蓖麻中还未见报道。在下一步试验中，可以将RcDELLA基因转入野生蓖麻中，以期获得DELLA蛋白过表达的矮秆蓖麻表型。

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