坏死性小肠结肠炎晚发和长病程动物模型的建立

王玲玲，金 芳，温博贤，冼 其，熊 慧，林楚琴，黄堃莹，江观银，黄 艳

（1.中山大学附属第六医院儿科，广东 广州 510655；2.广州市红十字会医院病理科，广东 广州 510220）

坏死性小肠结肠炎（necrotizing enterocolitis，NEC）是早产儿致死、致残的重要疾病，发病机制尚未完全阐明，临床缺乏确切有效的防治手段[1]。动物模型是研究人类疾病的基础平台，适宜的动物模型对NEC相关研究具有重要意义[2-3]。

目前公认的NEC模型是采用早产新生鼠，给予高渗配方奶人工喂养和缺氧、寒冷（或细菌内毒素LPS）刺激[Formula Feeding and Cold（or LPS）Asphyxia Stress，FFCAS（FFLAS）]进行诱导[2-4]，存活时间短（平均33.6～45 h[5]），不符合人类NEC“越早产越晚发”[6]的临床特点和长时间疗效观察的实验要求。建立晚发和长病程动物模型，是NEC研究的迫切需要。

最新研究发现，NEC“越早产越晚发”与潘氏细胞损伤有关[8,20]。本研究采用双硫腙（Dithizone，Dith）选择性破坏潘氏细胞，结合FFLAS（Dith/FFLAS法），对10日龄SD大鼠进行诱导，成功建立晚发和长病程NEC模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 10日龄SD大鼠，雌雄不拘，购自中山大学实验动物中心，随机分成4组：正常对照组（Control，n=32）采用母鼠喂养；双硫腙对照组（Dith，n=32）采用注射双硫腙+母鼠喂养；传统诱导组（FFLAS，n=32）；新法建模组（Dith/FFLAS，n=47）。

1.2 晚发NEC诱导 各组乳鼠均置保育箱（T 30～31℃，H 45%～55%）。Dith组和Dith/FFLAS组腹腔注射双硫腙（Sigma-Aldrich）75 mg/kg体质量[8]，Control组和FFLAS组注射等量溶媒。注射后4 h，Control组和Dith组回归母鼠喂养；FFLAS组和Dith/FFLAS组持续置保育箱，给予FFLAS刺激，具体方法参照文献[3]适当调整：插胃管注入高渗配方奶，1次/4 h，每次40 μl/g体质量；从第1次喂养开始，每12 h给予LPS（055：B5，Sigma）5 mg/（kg·次），加入配方奶中灌胃，之后置缺氧舱（容积1.4 L），予含氧5%的氮氧混合气体10 L/min通气10 min。

1.3 NEC长病程诱导 FFLAS组和Dith/FFLAS组持续给予FFLAS刺激，第7天（7 d）撤除LAS，并将FF由插胃管定量喂养改为奶嘴自主吸吮喂养，每次以半小时内拒绝3次为止。

1.4 实验终点和采样时间点 ①FFLAS组和Dith/FFLAS组于17日龄（7 d）脱离保育箱，添加面包、橙子和常规鼠饲料；所有组别均于21日龄离乳自主觅食，25日龄（15 d）结束实验。②采样时间点和样本预处理：于24 h、72 h、7 d三个时点每组随机抽取8只，以及实验终点（15 d）时所有存活鼠（Dith/FFLAS组7 d实际抽取7只，15 d为6只，其它时点及另3组各时点均为8只），麻醉处死，采集末段回肠2 cm，固定、包埋、切片。非抽样死亡（包括垂死者）亦及时解剖采样。

1.5 NEC组织学测评 肠组织切片HE染色，单人单盲光镜下观察，根据Jilling[4]标准进行评分，0：肠绒毛结构完整；1：绒毛顶端细胞脱落；2：绒毛中部结构破坏；3：绒毛完全破坏，但隐窝结构尚完整；4：隐窝破坏或透壁坏死；≥2分诊断NEC。计算各时点NEC患病率；各组损伤整体情况用（均值±标准差）表示。

1.6 潘氏细胞观察 肠组织切片AB/PAS染色标记潘氏细胞[8]，光镜下观察，隐窝基部含紫红色颗粒的锥形细胞为潘氏细胞。随机观察100个结构完整的隐窝，计数潘氏细胞阳性隐窝数，以此定量表示潘氏细胞发育水平。

2 结果

2.1 临床表现 Dith/FFLAS组48～72 h普遍出现腹胀、腹泻，个别出现血便，72 h以后肉眼血便消失，但体质量仍进行性下降（见图1），撤离LAS后缓慢回升，第12天时与实验初始体质量比较差异无统计学意义（t=-1.77，P＞0.05）。FFLAS组体质量增长缓慢，72 h内出现一过性大便松软，个别有轻度腹泻，但无腹胀、血便情况。Control组和Dith组无异常。

图1 时间-体质量变化百分率点线图Figure1 Plotting of weight change percentage with time-point

2.2 肠组织损伤情况和NEC患病率分析回肠典型组织学特点：Control组各时点回肠黏膜结构完整，绒毛长且排列紧密；Dith/FFLAS组24 h肠绒毛顶端上皮脱落，72 h和7 d肠黏膜充血水肿，绒毛脱落，15 d绒毛稀疏、矮短，结构紊乱。4组肠组织学评分见图2，差异均有统计学意义（F24h=3.00，F72h=17.05，F7d=14.09，F15d=4.08，P值均＜0.05）。各时点均以Dith/FFLAS组评分最高，不仅与Control组差异有统计学意义（P＜0.05），在72 h、7 d、15 d时点都显著高于FFLAS组和Dith组（P值均＜0.05，见图2）。而且，Dith/FFLAS组不同时点病变程度差异有统计学意义（F=6.60，P＜0.01）；72 h和7d损伤程度显著高于24 h（q72h-24h=5.23，q7d-24h=3.66；P值均＜0.05）和15 d（q72h-15d=4.84，q7d-15d=3.41；P值均＜0.05）。

Control组、Dith组肠组织病理均未达到NEC诊断标准。Dith/FFLAS组24 h、72 h、7 d、15 d时点NEC患病率分别为1/8、7/8、5/7、1/6，FFLAS组则为0/8、2/8、1/8、0/8，两组患病高峰均在72 h～7 d，Dith/FFLAS组显著高于FFLAS组（P72h=0.019；P7d=0.034），Dith/FFLAS组72 h与7 d患病率差异无统计学意义（P=0.369），但显著高于24 h（P72h-24h=0.005；P7d-24h=0.034）和15 d（P72h-15d=0.016）。

图2 4组各时点回肠组织学评分Figure2 Histological scores of four groups at each time point

2.3 生存分析 截至实验终点，Control、Dith、FFLPS3组均无非抽样死亡。Dith/FFLPS组生存分析如图3，3 d存活率76.22%，7 d 58.07%，15 d（已成功离乳独立生存）38.72%。死亡高峰发生在诱导开始的第1个24 h（5只），脱离保育箱的第1个24 h死亡3只，之后未再发生死亡；24 h～7 d之间死亡的10只，有6只发生在缺氧期间。

死亡的18只乳鼠肠组织损伤情况见图4：第1个24 h NEC患病率不高（1/5），之后死亡者几乎都有不同程度的NEC样病变。

图3 生存分析Figure3 Diagram of survival analysis

图4 Dith/FFLPS组非抽样死亡乳鼠回肠组织学评分Figure4 Histological scores of pups died without sampling of group Dith/FFLPS

2.4 潘氏细胞发育情况Control组随着日龄的增长回肠潘氏细胞数量增加，AB/PAS染色增强；Dith/FFLPS组潘氏细胞发育缓慢，不仅细胞颗粒少、着色浅，而且阳性隐窝数量少。

各时点潘氏细胞发育水平见图5。4组差异均有统计学意义（F24h=7.71，F72h=6.79，F7d=13.41，F15d=16.03，P均＜0.001）。Dith组和Dith/FFLPS组24 h潘氏细胞数量显著减少，Dith组72 h恢复（与Control相比，q=0.98，P＞0.05）并保持正常发育；Dith/FFLPS组潘氏细胞发育缓慢，直至15 d仍显著低于Control组（P＜0.05）；FFLAS组发育逐渐落后，至7 d和15 d与Control组比较差异有统计学意义（q7d=4.18，q15d=4.56；P＜0.05），但一直高于Dith/FFLPS组（P＜0.05）。

图5 4组各时点回肠组织潘氏细胞阳性隐窝数Figure5 Percentage of ileal crypts with Paneth cells at each time point

3 讨论

NEC没有自发动物模型，主要是模拟致病危险因素进行诱导[2]。目前唯一公认和成熟的NEC模型是采用早产鼠，给予高渗配方奶人工喂养，结合缺氧和寒冷刺激（FFCAS）进行诱导。该方法最初由Barlow等在1974年创立，后经多位学者改良，并将实验对象扩展到自然分娩的新生鼠（强调未进食母乳）[9]，方法上省去寒冷刺激，添加细菌内毒素灌胃（FFLAS）[3]。这些对FFCAS法的合理简化，已被广泛采用[10-12]。

FFCAS（FFLAS）法建立的新生鼠NEC模型，为NEC相关研究做出了重要贡献，但存在两个问题：①与人类NEC“越早产越晚发”的特点缺乏相似性。多中心队列研究显示[6]：NEC不仅“越早产越高发”，而且“越早产越晚发”。新生鼠不仅肠道菌群尚未建立，而且消化道成熟度远低于人类[2，7]，用于发病机制研究时，在某些方面可能会“失真”。②不能进行长时间观察，在治疗研究方面缺乏适用性。新生鼠FFCAS法诱导24 h后开始陆续发病[4]，72～96 h成模率52.7%～85%[13-15]，平均存活时间33.6～45 h[5，16]。为了有足够的观察期，目前的治疗学研究都是给药与造模同时进行，本质上属于预防性干预。成模后干预的报道只有一篇，仅观察了4 d[17]。因此，建立晚发和长病程动物模型，是NEC研究的迫切需要。

如果新生鼠出生一段时间后再诱导建模，不仅能满足“晚发”的要求，而且对疾病的耐受能力增强，或可带病存活较长时间从而建立长病程模型。但是，由于母乳的保护作用，以及随着日龄的增长肠黏膜自稳能力日趋成熟，FFCAS（FFLAS）法能否诱导成功是个问题。研究发现，母鼠喂养12～24 h的新生小鼠，NEC发病率明显低于母鼠喂养不足12 h者（44%vs 70%，P＜0.05）[5]；小鼠出生14 d后FFCAS法就不能诱导出NEC[2]。

FFLAS法在新生大鼠的72～96 h成模率为50%～75%[3]，尚未见用于较大日龄大鼠。本项目结果显示，10日龄SD大鼠在FFLAS诱导下体质量增长缓慢，临床无典型NEC症状；72 h成模率（2/8）。结合双硫腙进行诱导（Dith/FFLAS法），则普遍出现NEC临床症状，72 h成模率87.5%（7/8），两者的成模率和损伤程度差异有统计学意义（P＜0.05）。由此可见，随着乳鼠日龄的增加，FFLAS不再适宜的建模方法，Dith/FFLAS能有效建立晚发NEC模型。

Dith是重金属螯合剂，能选择性破坏潘氏细胞（富含锌）。新生鼠潘氏细胞尚未发育，随着日龄的增加逐渐成熟。Zhang等[8]采用14～16日龄小鼠，腹腔注射Dith，继之克雷伯杆菌灌胃（Dith/Kleb），16 h NEC成模率76.67%；单纯Dith注射或细菌灌胃都不能诱导NEC样病变。类似的方法在5日龄小鼠[8]和4日龄大鼠[19]都不能诱导NEC。这些研究提示：NEC发生在潘氏细胞相对成熟之后[8，20]。

潘氏细胞是肠黏膜最重要的天然免疫细胞，它不仅产生丰富的抗菌肽（AMP），而且产生多种促炎因子（TNF-a、IL-1β、IL-17等）[7，20]。

人类早产儿潘氏细胞的数量和功能远低于足月儿。NEC“越早产越高发”和“越早产越晚发”，这一临床现象提示：NEC患儿肠黏膜免疫功能不成熟，但又要有一定的成熟度，“过度炎症反应”才可能发生[7]。结合上述动物实验研究，有学者推测：早产儿生后需要一段时间，待潘氏细胞发育至一定的成熟度，有足够的促炎因子和反应能力的情况下，才能启动NEC[7，20]。

基于上述认识，2013年McElroy等[20]提出了NEC源自潘氏细胞损伤的“自底而上”假说（‘bottom up’hypothesis）：微生物或其毒素入侵肠隐窝，破坏潘氏细胞；受损的潘氏细胞从基底侧向黏膜固有层及微血管释放TNF-a、IL-1β、IL-17等促炎因引发炎症反应和血管内皮损伤、血栓形成，导致肠黏膜凝固性坏死。

本文注射Dith的两组乳鼠24 h潘氏细胞数量均显著减少，但Dith/FFLAS组24 h成模率很低，72 h和7 d成模率和病损严重程度最高；对死亡乳鼠的病理分析与这一趋势吻合。Dith组和FFLAS组均无死亡，Dith组无NEC样病变，FFLAS组各时点患病率和病损程度均显著低于Dith/FFLAS组，说明Dith/FFLAS组死亡和成模都不是Dith或FFLAS单一作用的结果，而是两者的协同效应。

但死亡峰先于成模峰，死亡峰在24 h内，这一时间段不论死亡还是抽样的乳鼠NEC患病率都非常低（图2、图3）。这一现象与上述Dith/Kleb法16 h成模的实验结果不同，不支持“自底而上”假说，但也不能否定这一假说，因为LPS不能模拟活菌的生物学行为，而且受试对象（大鼠vs小鼠）和发育水平（日龄）也不同。

对于Dith/FFLAS法能在10日龄SD大鼠成功诱导NEC，以及死亡峰先于成模峰的原因，我们推测：①Dith对潘氏细胞的破坏削弱了肠屏障功能，使得更多的LPS进入血循环，加重毒血症程度；②Dith使金属酶功能障碍，削弱了机体对毒血症和缺氧的耐受能力；③金属酶功能和肠屏障功能障碍增加了机体的NEC易感性。

目前尚未见对NEC“长病程”模型进行系统研究的报道。Zani等[11]在进行干细胞治疗NEC的实验研究时，为了有足够的疗效观察期，对FFLAS法作了调整：给予新生大鼠FFLAS刺激，48 h撤除LPS，96 h停止缺氧刺激，单纯给予高渗配方奶人工喂养（FF），第7天存活率不足20%，没有NEC患病率的描述。提前撤除诱导因素可能降低患病率，以此为代价谋求延长疗效观察时间，反映了传统NEC模型的局限性。

本项目Dith/FFLAS法诱导第7天NEC患病率71.43%（5/7），第15天病变仍未完全修复（图2），平均存活时间6.25天，说明本项目成功建立了长病程NEC模型。

本文Dith组体质量正常增长，72 h潘氏细胞数量恢复正常，提示此时Dith对机体的直接影响已经消失。而且，FFLAS组7 d组织学评分与Control组比较差异无统计学意义（见图2）。说明长病程NEC不是Dith或FFLAS直接所致，而是在Dith/FFLAS诱导成模后的病变迁延，是FFLAS阻碍肠黏膜修复的结果。

肠黏膜修复的主体是肠上皮干细胞（Intestinal Sterm Cell，ISC），与潘氏细胞紧密相邻；潘氏细胞是其“卫士”和“龛细胞”，对维持肠上皮稳态有重要意义[21]。本文不仅Dith/FFLAS组潘氏细胞恢复缓慢，而且FFLAS组潘氏细胞发育也明显落后，这与Estienne等[22]的研究结果一致，他们发现早期母爱剥夺使乳鼠潘氏细胞数量减少，功能发育迟滞。而且，细菌内毒素LPS抑制肠上皮修复[18]。LPS是TLR4的配体。最新研究发现：ISC表达TLR4，激活TLR4诱导ISC凋亡，导致未成熟小鼠NEC易感性增加和肠黏膜修复能力下降[23]。

因此，Dith/FFLAS法建立NEC长病程模型的机制可能是：Dith破坏潘氏细胞，人工喂养造成的母爱剥夺使之发育延迟，直接影响ISC生存的微环境，而且削弱了肠黏膜免疫屏障，使得肠腔微生物成分（如LPS）更易接触到ISC，与其表面的TLR4结合，激活ISC凋亡程序，从而削弱肠黏膜修复能力，使NEC病变迁延。撤除LPS后体质量增长也支持这一推断。

综上所述，本文结果说明：①传统的FFLAS法在10日龄大鼠的成模率低，不适合作为晚发NEC的建模方法；②Dith/FFLAS能成功建立晚发NEC模型，成模高峰为72 h，成模率87.50%；③在晚发NEC的基础上继续给予FFLAS刺激，能成功诱导NEC长病程模型，病变至少迁延至第7天，第15天仍未完全修复；④38.72%的模型鼠能成功离乳独立生存，观察期可任意延长。

本文首次对NEC长病程模型进行了初步系统的探索，率先用Dith/FFLAS法建立晚发和长病程模型，为NEC相关研究提供新平台。本模型尤其适合治疗学研究。

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