艾美耳球虫转基因技术研究进展*

段春慧 汤新明 张思新 胡丹丹 索 勋 刘贤勇

(中国农业大学动物医学院，北京 100193)

艾美耳球虫(Eimeriaspp.)是包括弓形虫、疟原虫、住肉孢子虫等在内的顶复门原虫中的一大类胞内寄生原虫。不同虫种的艾美耳球虫感染多种畜禽，尤其感染鸡的艾美耳球虫对养禽业造成巨大经济损失(李祥瑞, 2011)。长期以来，球虫病的防治以药物为主，耐药性及药物残留问题逐渐显现。鸡球虫活卵囊疫苗经历了强毒苗、弱毒苗的发展并得到广泛应用，其中弱毒活卵囊疫苗虽具备高效、安全等优点，但生产成本较高。因此，开发新型抗球虫药物及疫苗迫切需要寻找艾美耳球虫的特异性药物靶点或是抗原分子 (刘贤勇等, 2014)。

20世纪70年代基因工程技术的出现作为新的里程碑，标志着人类认识生命本质并主动改造生命的新时期开始。Berg等将SV40病毒DNA与噬菌体P22 DNA在体外重组成功，转化大肠杆菌 (Jacksonetal., 1972)，使本来在真核生物中合成的蛋白质能在细菌中合成，打破了种属界限。在刚地弓形虫和恶性疟原虫成功实现瞬时转染(Goonewardeneetal., 1993; Soldatietal., 1993)，使顶复门原虫的基因操作技术也从酝酿期进入发展时期。顶复门不同原虫转基因研究取得的突破和进展，使转基因技术成为研究顶复门原虫入侵、代谢等相关基因功能、研制新型疫苗 (如活载体疫苗和DNA疫苗) 和筛选新的药物靶基因等方面的有力工具。而艾美耳球虫的转基因研究也紧跟步伐进入探索阶段。

随着艾美耳球虫基因组分析研究的向前推进，其研究即将或已经进入后基因组时代。对艾美耳球虫基因及其基因产物的功能研究是发现有效疫苗和抗球虫药物作用靶位的必要前提，而转染技术将成为基因操作的有力工具。以往基因功能的研究局限于已知功能基因的比较和间接地推测，艾美耳球虫转基因技术的应用使球虫基因表达调控、药物抗性研究以及疫苗的研究进入崭新的发展时期。本文将对转基因艾美耳球虫的研究工作进行回顾和展望。

1 艾美耳球虫转基因技术的建立与发展

1.1 艾美耳球虫转基因技术的探索

自1993年，转基因技术首次在弓形虫成功报道以来，其他顶复门原虫的转染研究相继展开。而艾美耳属球虫的转基因技术起步较晚，至1998年，Kelleher等 (1998) 才首次使用报告基因β-半乳糖苷酶实现了柔嫩艾美耳球虫的瞬时转染，这也是对艾美耳球虫转基因操作的初步尝试。但因艾美耳球虫转染效率较低,其转染技术的发展受到一定程度的制约。郝力力等 (2007) 利用表达黄色、红色荧光蛋白的质粒实现了柔嫩艾美耳球虫不同发育阶段虫体内的瞬时转染，为艾美耳球虫转染技术的不断发展和广泛应用奠定了基础。因艾美耳球虫代表性虫株——柔嫩艾美耳球虫盲肠寄生的特点，利用泄殖腔接种转染后的子孢子成功实现了其稳定转染 (Yanetal., 2009)，同样的和缓艾美耳球虫也利用此种策略取得成功 (Qinetal., 2014)。与此同时，一方面我们实验室实现了巨型艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫的瞬时转染 (Zouetal., 2009)；另一方面，我们也通过翅静脉接种堆型艾美耳球虫子孢及泄殖腔接种毒害艾美耳球虫二代裂殖子成功实现了堆型、毒害艾美耳球虫的稳定转染 (未发表数据)。

在转基因技术发展的过程中，球虫研究者还对其他宿主寄生的艾美耳球虫进行了转染尝试。如寄生于大鼠的尼氏艾美耳球虫转染后的子孢子经口接种至胃酸中和的大鼠而成功转染 (Kurthetal., 2009)。而兔球虫中的斯氏艾美耳球虫、肠艾美耳球虫、中型艾美耳球虫、大型艾美耳球虫和黄艾美耳球虫则通过外科手术将转染后的子孢子直接接种于肠道而转染成功 (Shietal., 2016; Taoetal., 2017；未发表数据)。不同球虫虫种的成功转染(图1)大大推动了转基因技术在艾美耳球虫中的发展与应用。

1.2 艾美耳球虫转染技术的优化与发展

因艾美耳属球虫转染效率较低、体外培养困难及生活史复杂等众多因素的限制使转基因技术在艾美耳球虫的发展明显滞后于顶复门其他原虫。因此优化艾美耳球虫转染显得尤为重要，其中优化转染载体和转染方法是优化转染技术的两大核心部分。

1.2.1球虫转染流程: 优化鸡球虫转染技术，首先要了解鸡球虫转染流程。自成功实现柔嫩艾美耳球虫瞬时转染以来，艾美耳球虫转染技术取得一定程度的发展。根据构建转基因球虫的研究结果及经验，特将其转染流程简单总结如下：(1) 构建含有目的基因调控序列的报告基因载体。一般而言用于顶复门原虫转染的载体是由启动子、3’转录终止调控序列以及两者之间的一个完整开放阅读框组成。不同基因的启动子可以共用同一个3’转录终止调控序列。例如柔嫩艾美耳球虫MIC1和组蛋白4启动子可共用Actin3’转录调控序列 (Yanetal., 2009; Yinetal., 2011)。(2) 使用AMAXA Nucleofector系统中U-033程序或电穿孔方法转染经限制性内切酶线性化后的质粒及纯化后的子孢子 (裂殖子) 并使用DMEM培养基终止反应。研究证实线性化质粒比环形质粒转染效率高，因此转染前要对质粒进行线性化。(3) 转染后的子孢子 (裂殖子) 接种MDBK细胞于24 h后观察转染成功与否或者接种至鸡体内 (泄殖腔、静脉接种或手术) 经3～5代流式联合药物传代筛选出稳定转染群体。但这种转基因群体的遗传性状仍然是不一致的，表现为转基因整合位点的随机性。(4) 转基因球虫鉴定。经筛选后的稳定转染群体利用多种监测手段如免疫印迹 (Western Blot) 和间接免疫荧光 (Indirect Immunofluorescent Assay) 等鉴定外源蛋白的表达，同时用染色体步移 (Genome Walking) 或质粒拯救 (Plasmid Rescue) 或DNA测序等来确定转基因在球虫染色体上的整合位点。(5) 利用单孢子囊分离甚是单子孢子分离技术获得遗传一致的转基因艾美耳球虫系。经流式和药物联合筛选获得的转基因群体，其遗传性状仍不稳定，因此需要进行单孢子囊 (子孢子) 分离。我们实验室通过单孢子囊分离技术获得了一株遗传性能一致的转基因球虫系——表达黄色荧光蛋白的转基因球虫株EtM2e (Liuetal., 2013)。

图1 已经实现转染的艾美耳球虫种类Fig.1 The Eimeria species been successfully transfected

1.2.2转染载体的优化：载体是转染技术的核心部分之一，优化转染载体是提高转染效率的关键。顶复门原虫转染最初多用环形粒。Kelleher等 (1998) 首次报道的柔嫩艾美耳球虫的瞬时转染使用的也是环形质粒，转染效率仅为10-4～10-6。而经过不断探索，Black等 (1995) 将限制性内切酶介导的整合转染应用于弓形虫中并实现稳定转染，其转染效率提高了10～100倍，为提高艾美耳球虫的转染效率提供了借鉴。之后，研究者借鉴限制性内切酶介导的整合转染，探究了分别表达黄色荧光蛋白和药物筛选基因的质粒在球虫中共用的可行性，流式分选与药物筛选的结合显著提高了球虫的转染效率，自此转染效率提高近200倍 (Liuetal., 2008; Yanetal., 2009)，该项技术的突破，极大地促进了各部调控元件的优化。此外，利用双框表达载体实现外源基因在柔嫩艾美耳球虫中的表达 (Yinetal., 2011)，为利用双框表达策略启动不同外源抗原提供有益探索。国外研究者将药筛基因 (TgDHFR-TS)与荧光蛋白融合表达 (Hanigetal., 2012)，简化转染载体，提高转染效率，极大地加快了筛选速度。

此外，研究表明piggyBac转座子系统也可以应用于艾美耳球虫的转基因研究，被整合至基因组的DNA分子的特异性位点为TTAA，符合其转座特征，并获得稳定转染的球虫群体 (Suetal., 2012)，因此piggyBac转座子系统将有可能进一步提高球虫转染效率，那么piggyBac 转座子系统在艾美耳球虫的应用不失为一种优化方向。近来将猪捷申病毒的自剪切序列P2A引入球虫表达载体后实现了同一表达框中两个外源基因的非融合表达 (Tangetal., 2016)，为表达多基因的转基因球虫奠定良好基础，同时利用SAG13强启动子显著提高了其调控基因的转录和翻译水平，这也是提升转基因球虫表达异源抗原水平的有益尝试。因此，不断优化的载体促进了转染效率的提升，从而促进艾美耳球虫转染技术稳步发展。

1.2.3转染方法的优化：目前的转染方法主要有电穿孔转染、脂质体转染、显微注射、基因枪等方法，而在顶复门原虫研究中应用较广泛的是电穿孔转染。最初的柔嫩艾美耳球虫转染主要应用电穿孔转染方法，然而较低的转染效率促使人们去探索新的转染方法来改变这一现状。基于电穿孔转染的AMAXA Nucleofector转染系统的出现，显著提高了细胞的转染效率，并且可适用于艾美耳球虫转染。AMAXA Nucleofector是综合应用传统的电穿孔技术及细胞特异性细胞核转染液，通过调整优化的电转参数，直接把外源基因导入原代细胞及细胞系的细胞浆和细胞核中的一项技术。在转基因球虫研究中，国外球虫研究者Clark等 (2008) 首先利用AMAXA Nucleofector转染系统中的U-033程序结合限制性内切酶介导的转染显著提高球虫的转染效率, AMAXA Nucleofector系统是优化球虫转染方法的重要一步。

1.2.4艾美耳球虫卵囊转染尝试：由于子孢子转染操作较为费时费力，多个研究团队也进行了其他转染方法的尝试。基于子孢子转染受到众多限制，研究者一直在探索卵囊转染方法以简化繁琐的球虫转染程序。利用基因枪技术转染未孢子化卵囊后可以检测到外源基因的插入，这是优化球虫转染程序的一次大胆尝试 (Lietal., 2012)。利用病毒载体介导的体外转录系统转染柔嫩艾美耳球虫未孢子化卵囊 (Wangetal., 2017; Xinetal., 2018) 也是继基因枪技术之后卵囊转染的又一有益尝试。尽管现阶段的转染方法大幅度提升了转染效率，但也受到众多限制。因此我们仍须不断尝试与探索新的方法使球虫转染实现质的飞跃。

1.3 球虫转基因技术面临的问题与挑战

尽管当前艾美耳球虫转染已经取得了突破性的研究进展，但在基因操作技术和转基因球虫的应用方面仍面临诸多挑战。低转染效率一直是利用转基因技术研究艾美耳球虫的主要屏障，这就要求我们提高转染效率并简化转染步骤。首先转染效率问题是制约基因操作技术在球虫应用的重要一环。尽管限制性内切酶及球虫内源性强启动子的应用使球虫的转染效率从最开始的10-4～10-6提升了百倍，但其转染效率远低于弓形虫等顶复门其他原虫，利用转基因技术实现特定基因的过表达、敲除、插入及突变略显艰难，严重制约球虫基因操作技术的发展。其次因艾美耳属球虫体外培养较为困难，必须借助动物完成转染后球虫的生活史。众多的不可控因素，使球虫转染研究的步伐被迫放缓。再次，对子孢子进行转染操作繁琐、费时费力且使用范围具有一定的局限性，因此寻求更为便捷的转染方法是优化球虫转染的必要环节。目前，直接转染卵囊或者孢子囊就是最值得期待的技术突破。并且已利用基因枪、病毒载体介导的转染体系进行卵囊转染的探索 (Lietal., 2012; Wangetal., 2017)。此外，球虫作为疫苗载体的研究尚处于初级阶段，转基因球虫表达外源蛋白的量一直是大家关注并不断探索的节点。因此，在优化艾美耳球虫转染技术的道路上仍需要不断探索与尝试，以推进遗传操作技术在球虫的发展。

2 艾美耳球虫转基因技术的应用

2.1 转基因艾美耳球虫作为疫苗活载体

自1983年诞生第一个转基因生物烟草以来，大大推动了转基因技术的发展，尤其是在疫苗开发领域显示了越来越光明的前景。近年来随着生物技术的进步，兽用疫苗的研制和开发获得了快速发展。其中基因工程活载体疫苗因其可同时启动机体体液和细胞免疫并且可以构成多价乃至多联疫苗，使之成为近几年来新型疫苗研制最为活跃，也是最有希望的发展方向。基于球虫转基因技术的迅速发展，将转基因球虫开发作为活载体将成为研究活载体疫苗的有力工具。

在研究转基因球虫针对表达异源蛋白甚至是球虫自身蛋白激发宿主产生的免疫应答研究方面，国内外学者进行了逐步探索。有研究发现，与黄色荧光蛋白表达定位于胞浆的转基因球虫相比，黄色荧光蛋白表达并分泌至带虫空泡的转基因球虫能激发更好的黏膜IgA应答 (Huangetal., 2011)，为转基因球虫的免疫应答研究提供了很好的技术平台。国外研究者发现，表达空肠弯曲杆菌保护性抗原CjaA的柔嫩艾美耳球虫对免疫鸡群能提供部分抵抗空肠弯曲杆菌感染的免疫保护 (Clarketal., 2012)，为艾美耳球虫作为禽病疫苗载体提供了直接证据。此外有研究显示，柔嫩艾美耳球虫表达的传染性法氏囊病毒VP2抗原和传染性喉气管炎病毒糖蛋白抗原可被宿主的免疫系统所识别并使鸡产生特异性免疫应答 (Marugan-Hernandezetal., 2016)。同时因顶复门原虫基因的保守性，表达顶复门其他原虫的蛋白并不存在密码子偏好性，如柔嫩艾美耳球虫表达弓形虫SAG1蛋白 (Tangetal., 2016)，能够激发抗弓形虫感染的保护性免疫应答，推动了将球虫改造为禽类其他重大疫病病原的疫苗载体的发展。

在表达其他艾美耳球虫抗原基因的构建和测试中发现，柔嫩艾美耳球虫表达巨型艾美耳球虫的profilin、AMA1及IMP1基因分别刺激机体产生抗巨型艾美耳球虫的免疫保护 (Tangetal., 2018a; 2018b)，从而为减少疫苗组分、降低成本奠定基础。而基于不同艾美耳球虫虫种免疫原性的差异、通过导入外源佐剂分子提高艾美耳球虫免疫原性的研究结果证实，鸡的细胞因子 (如IL-2) 和IgY Fc片段可分别作为分子佐剂显著增强球虫的免疫原性 (Lietal., 2015; Qinetal., 2016)。

2.2 利用转基因艾美耳球虫进行基因表达调控研究

基因调控是现代分子生物学研究的中心课题之一。生物体内的基因在转录、剪切、翻译以及转变成具有生物活性的蛋白质分子之前的所有加工过程都是受着精细机制的调控。要了解艾美耳属球虫的生长发育规律、形态结构特征及生物学功能，就必须搞清楚基因表达调控的时间和空间概念。鸡球虫瞬时转染的实现，加速了基因表达调控的研究。利用表达报告基因的时间和强度，可以筛选到阶段特异性表达的优秀启动子和持续性表达的强启动子。例如柔嫩艾美耳球虫表面抗原蛋白SAG13的调控序列能显著提高其调控基因的转录和翻译水平，但其在柔嫩艾美耳球虫未孢子化阶段不能启动荧光蛋白的表达 (Tangetal., 2016)，而在兔黄艾美耳球虫和镰型艾美耳球虫所有生活史阶段均启动荧光蛋白的表达。此外，柔嫩艾美耳球虫的MIC-1也属于在未孢子化阶段不能驱动荧光蛋白表达的阶段性启动子 (Yinetal., 2011)。Actin和组蛋白4基因启动子能驱动荧光蛋白在球虫孢子生殖、裂殖生殖和配子生殖阶段持续性地高表达 (Shietal., 2008; Yanetal., 2009)。因此,通过转染技术可以鉴定和筛选种特异性或种间保守性启动和终止调控序列，使其成为研究基因表达调控的有力工具。

2.3 利用转基因艾美耳球虫进行功能基因研究

以往基因功能的研究局限于已知功能基因的比较和间接地推测，近年来转基因技术在球虫的应用加速了基因功能研究的准确化，使鸡球虫基因的研究现状大为改观。通过转基因技术，可以直观准确的了解相关功能蛋白在虫体细胞内的定位与分布。柔嫩艾美耳球虫组蛋白4基因的核定位序列能将黄色荧光蛋白定位到球虫子孢子、裂殖子、未孢子化卵囊等阶段虫体的核中 (Liuetal., 2008; Yanetal., 2009)。而弓形虫致密颗粒蛋白GRA8和疟原虫RIFIN蛋白的信号肽序列能够将黄色荧光蛋白分泌到带虫空泡内 (Shietal., 2009)。此外，柔嫩艾美耳球虫的膜锚定序列GPI及MCP2序列分别能够将外源蛋白定位到子孢子膜上和微线体上 (Marugan-Hernandezetal., 2017a; Marugan-Hernandezetal., 2017b)。另一方面，利用转基因技术，可以从分子水平上弄清控制入侵、运动、代谢、致病性和宿主特异性等生物学功能的重要基因。而基于CRISPR/Cas9 的基因编辑技术在球虫的不断探索将能够对于基因功能研究的推测进行有效验证 (Barrangouetal., 2014)。随着艾美耳球虫全基因组测序的推进，转基因技术将成为研究艾美耳球虫基因功能的重要工具。

2.4 利用转基因艾美耳球虫进行耐药性和新药物靶基因研究

长期以来，球虫病的防治以药物为主，耐药性及药物残留问题日益突出。因此，揭示耐药性分子机理显得尤为重要。疟原虫和弓形虫的DHFR-TS 中2～3个位点的突变导致乙胺嘧啶抗性 (Wuetal., 1996)，因而可以用来筛选转基因虫系。同样的，研究者发现弓形虫的DHFR-TS诱发2个点突变后的耐药基因同样适用于艾美耳球虫 (Clarketal., 2008)。基于测序筛选出的耐药基因借助转染技术、利用基因突变、敲除等策略进行验证，从而揭示耐药分子机理及筛选新的药物靶点。此外，顶复门原虫代谢途径与宿主相比差别较大，可选取调控代谢等的基因或分子作为新的药物靶点候选分子。因此转基因技术将成为揭示耐药性分子机理及筛选新的药物靶点的有效手段。

3 总结与展望

艾美耳球虫转基因平台经历十多年的探索式发展，为新型球虫病疫苗研发描绘了光明前景。同时，艾美耳球虫基因组计划的不断深入研究，极大地推动了转基因技术在艾美耳球虫的应用。此外，大量未知基因的功能研究及药物靶基因和保护性抗原基因的筛选为转基因技术提供了更为广阔的应用平台。然而艾美耳球虫的转染效率及外源蛋白的表达量成为制约其遗传操作的瓶颈。如何提高转染效率和转基因球虫表达外源蛋白的量也是我们亟待解决的问题。基于CRISPR/Cas9的基因编辑技术在球虫的探索研究将有望将转基因球虫的发展推向新的高度。鸡球虫转染技术作为强大的研究工具，将有效推动转基因球虫作为疫苗活载体的研究。