我国鸡球虫早期研究概况*

刘 婕 刘贤勇 蔡建平 林昆华 索 勋**

(1.中国农业大学动物医学院，北京 100193； 2.中国农业科学院兰州兽医研究所，甘肃兰州 730046)

1674年列文虎克(Antonie van Leeuwenhoek)首先在兔胆管中发现斯氏艾美耳球虫Eimeriasteidai卵囊，1875年Schneider以德国动物学家Theodor Eimer之名建立艾美耳属(GenusEimeria)，但直到1891年法国著名兽医学家、现代兽医寄生虫学主要奠基人阿尔瑟德·瑞利(Louis-Joseph Alcide Railliet)等首先报道罹病鸡盲肠中存在大量柔嫩艾美耳球虫(Eimeriatenella，当时称Coccidiumtenellum，1913年由Railliet重新命名为现名)卵囊(Railliet，1913)，才将艾美耳球虫与鸡的严重消化道损伤联系起来(Chapman, 2014)。此后Railliet等对家养鸡和鹌鹑等的一系列调查及Harold B. Fantham、Walter T. Johnson、Edward E. Tyzzer等球虫学先驱们对球虫生活史、球虫感染的宿主特异性和致病性、鸡球虫种的分类及流行调查系列研究，使人们充分认识到球虫病对养鸡生产的重大危害。

1904年北洋马医学堂建立，以实验科学为主要理论基础的西方现代兽医学正式传入中国，开始了病原生物学教学和研究的萌芽(李青山，2015)。1936年7月，中国畜牧兽医学会成立，但是由于人力、物力、财力不足及战争环境的影响，科研工作受到了极大地制约，第二年学会工作就陷入了停滞状态。新中国成立后，百业待兴，1950年起，熊大仕等畜牧兽医界人士在北京发起恢复学会的活动，科研工作在动荡中艰难进行(http://www.caav.org.cn/showNewsXHJSDetail.asp?nsId=13)。自70年代末，孔繁瑶开始组织开展兽医寄生虫培训班，介绍国际寄生虫学进展，极大地推动了我国寄生虫学的发展。1986年，孔繁瑶等兽医寄生虫学家在广西南宁创立了中国畜牧兽医学会寄生虫学分会，兽医寄生虫学方面的研究工作进入了一个新的局面。

第二次世界大战结束后，随着科学技术的进步与发展，禽类养殖业进入迅速发展阶段，开始步入机械化(赵义斌，1991)，50年代末在我国北京、上海等主要城市周边开始出现集约化养鸡生产，虽然只是处于萌芽阶段，但是有鸡的地方，就有鸡球虫的存在(索勋，1998)，伴随着集约化养鸡业的发展，鸡球虫病的暴发与蔓延也随之而来。1951年廖延雄等发表的《南昌数种重要的家禽內寄生虫病》，对鸡球虫病的流行情况及药物防治进行论述，是我国鸡球虫病流行调查的首次报道。20世纪60年代初，熊大仕带领学生在国内开展鸡球虫病及其防治的研究，但由于文革时期带来的一些限制因素，80年代才将研究的内容整理成文、发表见刊。改革开放后，随着我国经济建设的快速发展，集约化养鸡生产日新月异，至1990年全国肉鸡出栏量达到21亿(刘春芳等，2011),鸡球虫病研究也如雨后春笋般迅速展开。孔繁瑶、许绶泰、汪志楷、蒋金书、林昆华、张勤、杨振中、史天卫、段嘉树、谢明权等兽医寄生虫学家先后组织与带领研究生和研究团队进行了鸡球虫病的流行病学、药物防治和药物研制、抗药性评价、免疫预防、鸡胚和细胞培养、早熟选育等系列研究，取得了一系列进展。我国学者仿制合成了氯苯胍、氯羟吡啶、二硝托胺、尼卡巴嗪、地克珠利、马杜霉素等抗球虫药物，研制生产了海南霉素和鸡球虫病早熟致弱活卵囊疫苗，成功主办第二届亚洲球虫病国际大会和第十届世界球虫病大会。至今，我国学者在国际学术期刊年发表球虫病研究论文已近PubMed收录该领域年发表论文数的40%，成为国际球虫病研究的主力军。

目前，美国农业部农业研究中心动物寄生虫病研究所寄生虫学家、美国科学院院士Jitender P. Dubey博士正着手组织编写《家畜、宠物和人的球虫病》专著，旨在分析过去28年间即1990年至今的球虫病的研究概况，本文作者索勋受邀参与编写中国鸡球虫病研究一章。而到2018年为止，国内中文期刊已发表的鸡球虫研究、诊疗或报道相关文献高达3 600余篇(数据来自中国知网)，数目庞大、内容繁多，发表时间的年限跨度长。所以，不仅是1990年以后的研究对分析本领域的研究发展具有参考价值，1990年以前的早期研究同样是我国鸡球虫研究发展进程中不可忽视的重要一笔。因此，本文选取1990年作为时间截点，对以“鸡球虫”为主题在“中国知网”和“万方数据库”中进行检索并对查找的文献逐一遴选研究性文章，归纳我国鸡球虫研究的早期发展概况。从发表文献的时间来看(图1)，尽管我国对鸡球虫及鸡球虫病的研究到目前为止有近70年的历史，但可以说，我国鸡球虫病研究真正起步始于1980年代，查明病原、明确流行特点、仿制药物合成工艺、药效评价等是当时主要的研究内容。

图1 1951—1990年国内主要期刊历年发表鸡球虫病研究文章数量Fig.1 The number of articles about coccidiosis research published in major domestic journals from 1951 to 1990

1 研究技术

在早期鸡球虫研究中，观察描述是基本方法，尤其是在虫种分布的调查方面，通过对鸡球虫卵囊、裂殖体等不同发育阶段虫体的形态特征(王善志, 1980)与寄生部位的描述(林昆华等, 1981；张宝祥等, 1986)等鉴定虫种及流行情况，无疑这些结果的准确性存在较大误差。伴随着许多技术与学科的发展，实验寄生虫学在60年代以后逐步兴起(索勋等，2003)，在描述寄生虫学的基础上，实验技术成为研究鸡球虫形态、发育及致病性等方面的重要手段。

研究鸡球虫最基本的一点就是要明确虫种，种等分类学的问题搞不清，治疗等相关研究就无法开展。而在自然状态下，鸡球虫病往往是混合感染，通过单卵囊分离感染(林维庆等，1980；陈建斌等，1988)获得纯种为种的鉴定提供了一个有效的方法。此外，还引进和建立起一系列球虫学研究的基本技术，比如：改良韦氏法纯化卵囊以减少杂质，提高收获量(朱冠等, 1987)，用更简便、成本更低的方法收取大量纯净的裂殖子(Xieetal., 1990)，寻求适宜浓度的胰酶和鸡胆汁实现子孢子的体外脱囊(赵开元，1985)。随着生物技术的崛起，特别是在19世纪70年代以后，兽医寄生虫的研究有了新面貌(李祥瑞等，1992)。其他技术逐渐渗透，如利用切片技术观察球虫的内生性发育(张振岚等, 1990)，利用电镜技术观察卵囊的脱囊过程(朱冠等, 1990)以及人们逐渐认识到细胞培养技术在原虫研究中的重要性(李观娣，1984)。

2 流行病学

80年代，养鸡业的集约化程度越来越高，规模不断扩大(赵义斌，1991)，鸡球虫病也在养鸡业的进一步发展中更加受到养殖户及科研工作者的重视。认识鸡球虫病的流行病学特点对鸡球虫病防治至关重要。早在1959年，在对鸡内寄生虫调查时就涉及到鸡球虫的形态描述(何承德，1959)，到1990年，可查到的发表于国内主要期刊的相关报道共有17篇,多是对某一地区鸡球虫种类进行初步调查。

当时，在世界范围内，对鸡球虫虫种数目的认定并不统一，根据Becker(1959)的论述，有8种鸡球虫，加上Edgar等(1964)发现的新种，可达13种之多。当时大部分学者公认有以下9种：柔嫩艾美耳球虫Eimeriatenella、堆型艾美耳球虫E.acervulina、早熟艾美耳球虫E.praecox、毒害艾美耳球虫E.necatrix、巨型艾美耳球虫E.maxima、布氏艾美耳球虫E.bruntti、和缓艾美耳球虫E.mitis、哈氏艾美耳球虫E.hagani、变位艾美耳球虫E.mivati(林昆华等，1981)(哈氏艾美耳球虫和变位艾美耳球虫现已认为是无效种)。明确虫种是重点，并且这在任何时候的流行病学调查中都是首要且基本的任务。80年代以前，我国并没有整理出流行于我国的鸡球虫病系统资料，所以80年代及以后所进行的鸡球虫流行病学在当时对研究区系分布具有不可替代的重要参考价值。

2.1 虫种鉴定

虫种鉴定的依据主要包括4个方面：卵囊形态特征(表1)、最短潜在期、最短孢子化时间以及虫体寄生部位。卵囊的形态学观察主要包括卵囊的颜色、大小、形状，有无卵膜孔和残体，以及极体的形状、数目及位置(林昆华等, 1981；白启, 1981；廖丽芳等, 1984；朱冠等, 1986)。由于当时计算机等电子设备的使用并未在我国普及，科研工作者均是通过光学显微镜观察后手绘作图。潜在期与最短孢子化时间的测定可能由于地方株不同、培养的温度等环境因素不同以及感染宿主的个体差异等原因，不同文献中所报道的均有不同。对于寄生部位的观察则是将感染球虫后一定时间的鸡剖杀，取肠道，观察肠道病变，刮取肠黏膜，抹片镜检，确定虫体的寄生部位以及肠道病变部位与特征。

表1 卵囊形态特征Tab.1 Morphological characteristics of oocysts of chicken coccidia

图2 鸡球虫卵囊形态Fig.2 The shape of chicken coccidian oocysts参考文献(林昆华等，1981；郭媛华，1983；黄德生，1986)绘制。a.巨型艾美耳球虫; b.布氏艾美耳球虫; c.柔嫩艾美尔球虫; d.毒害艾美耳球虫; e.早熟艾美耳球虫; f.堆型艾美耳球虫; g.和缓艾美耳球虫。Reference: Lin et al.,1981；Guo,1983；Huang,1986. a. E. maxima; b. E. brunette; c. E. tenella; d. E. necatrix; e. E. praecox; f. E. acervulina; g. E. mitis.

2.2 流行特点

只有当外界环境中的球虫卵囊完成孢子化后才具备感染能力，而温度与湿度影响着卵囊的孢子化速度与寿命，最适孢子化的环境温度是20～32 ℃，湿度为40%～90%(赵公舜，1988)。影响鸡球虫病流行情况的因素有很多，季节和地区的气候条件、地理差异、鸡的品种与日龄等都与之密切相关(李超等，2018)。

3 病例诊断

早期鸡球虫病诊断主要是通过对患鸡的临床症状观察、病理剖检以及结合镜检观察球虫卵囊的形态特征来实现的(表2)。在当时，解决实际生产问题是根本目的——通过对养鸡场的自然病例进行分析来寻找病因及诊疗对策。临床上，往往还需要研究人员对可能出现混淆的相似病症，比如雏鸡坏死性肠炎，做出鉴别诊断(何维明等, 1981)。

4 药物研制与药效评价

鸡球虫病每年给养禽业造成巨大的经济损失,所以对于鸡球虫病的防治问题一直以来都是相关研究者关注的重点。自1939年Levine首先发现磺胺类药物的抗球虫作用后(Levine，1939)，世界各大主要制药集团(公司)也先后投入大量人力和财力进行抗球虫药开发，至1988年发现森杜拉霉素(Seduramycin)并推向市场的50年间，先后研制开发了40多种抗球虫药物(邹莹，1988)，其中30多种药物广泛商业化应用，药物预防成为防治鸡球虫病的主要手段。自50年代末，鸡球虫抗药性被发现以来，科研工作者更加致力于新药的开发，但是耐药性发展迅速，新型抗球虫药物使用3～4年或更短时间就会产生耐药虫株(赵开元等, 1985)，所以研制新药是确保有效防治鸡球虫病效力的重要工作。不同药物在国际与国内开始使用的时间以及耐药性出现的时间均有不同，在宿主体内发挥作用的高峰期也有差异(表3)。

表2 鸡球虫病诊断Tab.2 Diagnosis of chicken coccidiosis

主要参考文献(赵永福等，1987；索勋，1998；梁长钧，1990)整理。

Reference:Zhaoetal.，1987；Suo，1998；Liang，1990.

4.1 化学合成类药物

磺胺类与硝基呋喃类药物是我国早期一直使用的鸡球虫病防治药物，而非专门的抗球虫制剂，70年代时有报道称在北京地区鸡球虫对呋喃西林已经出现了较强的耐药性。我国抗球虫药物的研制始于1977年，华北农业大学(今中国农业大学)研制出了第一个国产抗球虫病的新药——球痢灵，同年，氯苯胍也在我国首次合成，上海农科院畜牧兽医研究所对其研究发现，30 ppm对防治鸡球虫病即有显著疗效，但是80年代初，某些地区就已经显示出它的抗药性。改革开放后，随着我国养鸡业的快速发展，大量跨国制药集团(公司)的专用抗球虫药物逐步进入中国市场，我国兽医寄生虫学工作者在承担这些药物的抗球虫效果评价之同时，与药物化学、有机合成等学科专业人员合作，开始进行非专利药物的仿制合成工艺研究，先后研制开发出氯苯胍、氨丙啉等的合成工艺(上海农科学院畜牧所鸡球虫病防治研究组，1979；杨振中等, 1983；沈瑞洲等, 1984)。但同样，在开始使用该药物时防治鸡球虫病效果优良，反复使用后，1987年在广东就已发现抗药虫株(陈汉忠，1990)。相对于其他一些抗球虫药，尼卡巴嗪抗药性产生缓慢，它是国际上最早研制成功的抗球虫药，从1955年问世，一直到80年代在国内外都可以称得上是比较理想的抗球虫药(史天卫等, 1985)。自使用抗球虫药物进行鸡球虫病防治以来，抗药性一直都是不容忽视的问题，球虫对某种药物的抗药性一旦产生，其防治效果就会下降甚至失去存在的价值。

4.2 聚醚类抗生素

抗生素是微生物的次级代谢产物，曾名为“抗菌素”。1974年，Westley首次将分子中含有多个环状醚键的抗生素命名为聚醚类抗生素(阎晓菊等, 1987)。它具有离子载体的性质，将阳离子转运透过细胞膜，破坏球虫细胞膜内外渗透压，使得虫体肿胀死亡从而起到抗球虫作用(于咏兰等, 2000)。早期作为抗球虫药物的聚醚类抗生素有莫能菌素、盐霉素、拉沙里菌素等。

4.3 中草药

中草药在我国已有数千年的历史，使用中草药或中草药提取物来防治鸡球虫病是我国特有的防治方法。其成本低廉、药源丰富，可就地取材，更重要的是，它们毒副作用小、不易产生抗药性，更加安全可靠。早在1978年，就有人尝试用蟾酥、雷公藤、辣蓼、穿心莲来防治包括鸡球虫病在内的鸡病，将雷公藤、辣蓼、穿心莲直接做草料喂鸡、蟾酥煎煮做饮水，再结合传统的针刺疗法，发现在临床上可取得很好的防治效果(谌澄光，1978)。此外，青蒿(朱印生，1981)、苦参、常山、仙鹤草、地榆等在临床上也都已取得满意的疗效(董华富, 1984)。

其中，青蒿药用在我国已有数千年的历史，主治疟疾(云南地区五二三协作组，1978)。早在一千多年前东晋葛洪所著《肘后备急方》中，就有青蒿抗疟的记载(王满元，2012)；屠呦呦等科研工作者在传统中药—“草根树皮一锅汤”的基础上对青蒿经过精制、提取等一系列操作得到其有效成分—青蒿素，这是将传统中药与现代科学理论和方法相结合的产物(Tu, 2011; 李连达等，2015)，对治疗疟疾有杰出贡献。而在非疟疾病中，它同样发挥着重要作用，有实验表明青蒿素及其合剂(北京市门头沟区兽医站，1983)、衍生物(丁璟昌，1984)对防治鸡球虫病有显著疗效。青蒿素仅从青蒿中提取或合成得到(韩福杰，1989)，中国拥有世界上超过80%的青蒿素资源(王满元，2012)，它的出现展现了中国“古为今用”的科学力量。

表3 早期使用的几种抗球虫药物Tab.3 Use of several anticoccidial drugs in early time

b.主要参考文献(朱模忠, 1984；樊生超，1990；常晓辉等，2011)。

Mainly refer to(Zhu, 1984；Fan，1990；Changetal.，2011).

5 免疫预防

自专用抗球虫药物出现以来，到19世纪80年代，世界范围内出现的抗球虫药物种类已达40～50种之多。药物防治在养鸡业中一直是控制鸡球虫病的主要手段，但是由于药物费用昂贵，以及反复使用同种药物易产生耐药性虫株等问题，免疫预防逐渐受到科研工作者的关注。过去人们就发现，在防治过程中，相对于完全抑制卵囊产生的抗球虫药物，允许产生少量卵囊的抗球虫药物更可取，因为少量卵囊刺激宿主产生免疫保护在实际生产中具有重要意义(柯新明等，1990)。

5.1 免疫机制

我国对鸡球虫免疫的研究起步较晚，早期对于鸡球虫病免疫应答机制的认识多是参考国外文献，并对其进行整理、发表综述。鸡球虫要完成复杂的生活史需要经历多种发育阶段，所以，宿主在病原刺激下所激发的免疫应答具有多样性(王宗仪，1985)。体液免疫、细胞免疫、局部免疫是鸡球虫免疫的3种重要方式。体液免疫主要通过刺激腔上囊B淋巴细胞产生IgG、IgM、IgA等抗体来实现，细胞免疫主要通过刺激胸腺的T淋巴细胞分化、增殖识别抗原来实现。其中，细胞免疫居主导地位，体液免疫居次要地位(晋希民, 1981)。1977年，Davis发现肠道内含有不同于血清中的IgA在子孢子入侵时发挥抵抗作用，这种IgA是黏膜免疫产生的分泌型IgA(SIgA)，是参与局部免疫反应的主要物质(樊生超, 1990)。

5.2 球虫病疫苗的研制

早在30年代人们就发现，成功抵抗鸡球虫感染后的鸡可以获得坚强的免疫力(王省良，1990)，所以运用有活力的正常毒力株球虫卵囊可以使鸡产生良好的免疫保护。王宗仪(1988)用柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊以不同计量一次和多次感染雏鸡进行免疫实验，发现逐渐增大剂量反复感染雏鸡可以使其获得更牢固的免疫力，但是大剂量的活毒卵囊对宿主会造成一定损伤。所以，虽然毒力株可以诱导机体产生免疫保护，但是存在极大的安全隐患。

Long(1965)首次报道通过鸡胚接种获得柔嫩艾美耳球虫，并于1974年发现通过在鸡胚上传代可以获得致病力减弱、繁殖力下降而免疫原性良好的虫株(Long,1974)。1978年，上海农业科学院畜牧兽医研究所杨振中等运用同样的方法选择柔嫩艾美耳球虫虫株，通过10年的研究，研制出了柔嫩艾美耳球虫弱毒虫苗，并对其安全性、保存期和免疫期以及田间免疫观察进行了报道(杨振中等, 1985； 1986；陈金伟等, 1988)，发现其免疫保护效果良好。但是弱毒疫苗仍是活疫苗，在相关免疫试验中仍存在对宿主致死的现象(樊其林等, 1986；赖大煦等, 1988)。此外，是否会出现毒力返强也是科学家们所担心的另一个问题，因此，灭活疫苗及亚单位疫苗的研制成为科学家研究的新方向。但是受到分子生物学技术等方面的限制，这些工作在早期鸡球虫研究中还处于空白(王省良，1990)。

6 营养性饲料添加剂

早期关于鸡球虫研究的文献中关于饲料添加剂的报道为数不多，主要是综述类文章。有些学者将氨基酸、矿物质、维生素这些饲料中本身就存在的物质称为补充物，只有像抗生素这种饲料中原先没有的成分才称为添加剂(徐维墉，1986)。但有些学者则把这两者归为营养性与非营养性添加剂(周毓平，1988)。抗生素和化学合成药物等作为饲料添加剂时同样是为了防治鸡球虫病，但是由于药残和耐药性的问题，一些药物如今已被禁止再做添加剂使用。一些研究者试图寻找其他饲料添加剂来代替抗球虫药物的使用。所以，我们这里想要着重阐述的是营养性添加剂的使用。

氨基酸是组成蛋白质的基本单位，饲料中适当的添加蛋氨酸、赖氨酸、色氨酸以补充鸡体自身合成的不足，可促进其生长与抗病能力；维生素调节着机体的新陈代谢，维生素A、C、D、E、K、H等均是饲料中常用的添加成分。有实验表明，在饲料中添加维生素和微量元素会对鸡的增重起促进作用，增强鸡的抗病能力(陈宙，1984)。此外，还有将植物或其加工品作为补充添加剂，其实就是将中药作为饲料添加剂，这在我国古代就有记载(张克家，1986)。它们在生产与防治上都能起到一定作用，更重要的是，植物作为一种天然成分，给动物本身带来的伤害小而可控。饲料添加剂种类多样，合理规范的使用饲料添加剂在任何时候都是保证养殖业健康发展的要素之一。

7 结语

从早期发表文章的数量与研究内容来看，我国对鸡球虫的研究起步晚于西方国家，并且由于资金不足、设备落后、人才短缺等原因以及一些社会因素，难以达到国际水平。从研究内容来看，鸡球虫种类的调查等病原学研究取得了一定的进展，利用观察描述的方法研究鸡球虫的区系分布为球虫病防治等研究工作的开展奠定了一定基础。实验技术的掌握与药物研制的水平虽然不及西方，但一直在紧跟前沿，奋力追赶；生物技术的渗入丰富了实验技术手段，化学药物的更新保证了药物防治效力；单卵囊分离、卵囊纯化等基本球虫实验操作不断优化；仿制合成的一系列国产抗球虫药物及球虫早熟活疫苗的成功研制为球虫病的防治带来了福音。但是，当时分子与免疫层面的寄生虫学研究还未深入开展，PCR、基因工程等分子生物学技术的应用还处于空白。90年代以后，免疫诊断等新的诊断技术出现，鸡球虫免疫保护机理及入侵的分子机制等分子水平方面的研究进一步发展，核酸疫苗、活载体疫苗等多种新型鸡球虫疫苗也取得了一定的成就；我国对鸡球虫的研究在不断向前推进。

致歉在中文数据库中查找1990年以前所发表的鸡球虫病相关文章，由于检索主题词的差异，在不同数据库中获取的文章数目有所不同，整理后大致有250余篇，有些年代久远的文章难以获取。由于文章数目多，以及有些研究工作可能开展于1990年以前，但文章却发表于1990年之后等原因造成查找缺漏、对文献整理不到位，致使并不能将所有研究及作者一一提及，在此深表歉意。但不可否认，他们为鸡球虫病研究做出了杰出贡献、为推动鸡球虫研究工作起到了不可忽视的重要作用。