肝细胞癌组织miRNA-155水平变化及其对预后的影响

左芳，朱中梁，汪宏良

本文通过检测HCC癌组织miRNA-155水平，分析了不同miRNA-155水平患者的预后情况，以探讨检测肝癌组织miRNA-155对HCC患者预后的意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2013年1月～2014年5月我院收治的50例HCC患者，男28例，女22例；年龄为38～78岁，平均年龄为（57.92±8.16岁）。符合2005年世界卫生组织（WHO）发布的HCC诊断标准[1]。对手术切除的肝癌组织进行病理学检查，根据Edmondson分级标准[2]，Ⅰ级10例，Ⅱ级15例，Ⅲ级12例，Ⅳ级13例。另取50例正常肝组织（肝血管瘤32例，肝破裂18例）作为对照组，男30例，女20例；年龄42～75岁，平均年龄（56.28±8.16岁）。

1.2 肝组织miRNA-155检测 采用荧光定量PCR法检测。Trizol试剂（广州国奥生物技术有限公司）；qRT-PCR试剂盒miScript system（美国 Qiagen公司）；ABI7700定量PCR仪（美国PE公司）；氯仿、异丙醇、无水乙醇等未特殊说明的试剂均为Sigma公司产品。PCR方法[3]：采用液氮碾磨所需肝组织标本，采用Trizol试剂一步法提取组织总RNA。使用紫外分光光度计检测总 RNA的A260/A280比值在1.8～2.0。依据hsa-miR-155 miScript system试剂盒说明书进行RT-PCR实验。逆转录体系为20μl，按下列条件进行逆转录：37℃ 60 min，95℃ 5 min。PCR反应体系也为20μl，按以下条件在ABI7700定量PCR仪上进行反应：起始激活 95℃15 min；94℃15 s，55℃30 s，70℃30 s，共 30 个循环。RNA U6作为内参，反应条件同上。实验重复3次，所得数据运用RQ=2-△△Ct方法进行分析。

1.3 统计方法 应用SPSS 18.0软件处理，计量资料以（±s）表示，采用 t或方差检验，计数资料采用 x2检验，绘制ROC曲线确定miR-155对HCC预后的预测价值的最佳截断点，采用 Kaplan-Meier法进行生存分析，采用 Cox回归行多因素分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同分级HCC和正常肝组织miRNA-155水平比较 癌组织miRNA-155水平明显高于正常肝组织，且随着HCC分级的增高其miRNA-155水平也升高，组间差异均具有统计学意义（P＜0.05，图1、表1）。

2.2 ROC曲线分析 根据术后患者生存情况绘制miR-155判断HCC患者预后的ROC曲线，结果显示以miR-155=2.5为截断点，其AUC为0.919，判断患者生存的敏感性、特异性、阴性预测值和阳性预测值分别为91.3%、93.5%、85.3%和88.6%（图2）。

2.3 肝细胞癌患者生存情况 对50例HCC患者随访2年，平均生存时间为20.6±4.6个月，2年生存12例（24.0%）；17例肝组织miRNA-155在2.5以上者平均生存期为9.4±2.8个月，2年仅生存3例（10.71%），则表明肝组织miRNA-155高水平患者其生存率明显低于miRNA-155低水平患者，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图1 肝组织miR-155水平

泳道1:对照组；2:HCCⅠ级；3:HCCⅡ级；4:HCCⅢ级；5:HCCⅣ级

表1 不同分级HCC组织与正常肝miRNA-155水平（±s）比较

表1 不同分级HCC组织与正常肝miRNA-155水平（±s）比较

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与对照组比，①P＜0.05；与 HCC Ⅰ级比较，②P＜0.05；与HCC Ⅱ级比较，③P＜0.05；与HCC Ⅲ级比较，④P＜0.05

2.4 影响HCC患者预后的单因素分析 通过单因素Cox回归分析，发现不同HCC分级、不同肿瘤大小、肿瘤是否转移、是否静脉侵犯、不同肿瘤分化程度和高低肝组织miRNA-155水平患者间生存期均存在统计学差异（P＜0.05，表2）。

2.5 影响HCC患者预后的多因素分析 通过多因素Cox回归分析，发现肿瘤体积大、肿瘤转移、静脉侵犯、肿瘤高分化和癌组织miRNA-155高水平为影响HCC患者预后的独立危险因素（P＜0.05，表3）。

图2 miR-155对HCC预后预测的ROC曲线

表2 影响HCC患者预后的单因素分析

表3 影响HCC患者预后的多因素分析

3 讨论

本文通过多因素Cox回归分析发现肿瘤直径＞5 cm、发生肿瘤转移、静脉侵犯、肿瘤细胞呈高分化和肿瘤组织miRNA-155高水平均为影响HCC患者预后的独立危险因素。

miRNA-155是一种典型的多功能基因，属于一种潜在的致癌或抑癌基因，其下游基因可介导如炎症、免疫造血细胞的分化及心血管疾病等多种病理生理过程[4-8]。既往研究表明，乳腺癌组织miRNA-155水平与正常乳腺组织存在明显差异，结果提示miRNA-155水平与肿瘤的病理特征和生物学特征相互联系[9]。也有研究者证实miRNA-155在胰腺癌组织和胰腺癌细胞株高水平存在，随后还发现其可作为诊断早期胰腺癌的重要标志物之一[10-12]。除此之外，也有资料报道[13-17]，在肾透明细胞癌患者的癌组织及头颈部和甲状腺癌组织miRNA-155也较正常组织明显升高。由此看来，miRNA-155与肿瘤的发展有着密不可分的关系，并可在一定程度上促进肿瘤的发展。但是，在目前研究领域，关于miRNA-155在HCC组织中的水平及其与HCC患者预后的关系尚未完全清楚，也缺乏足够大量的研究报道[18]。本研究结果提示正常肝组织miRNA-155水平明显低于肝癌组织，与既往研究一致[19]。在肺癌研究中，发现miRNA-155与肺鳞癌患者预后密切相关。随着miRNA-155水平的升高，肺腺癌A549细胞和非鳞癌H157细胞增殖加快，表明miRNA-155可促进肺癌的发展[20]。本研究采用ROC曲线分析发现，当miR-155相对水平在2.5时对HCC患者预后具有较高的预测价值。本研究显示，miRNA-155较低水平（＜2.5）的 HCC患者其术后2 a生存率明显高于miRNA-155高水平（＜2.5）的HCC患者，且通过多因素Cox回归分析得知miRNA-155高水平属于HCC患者预后差的独立危险因素之一。我们的研究发现miRNA-155在术前高水平患者术后生存率显著低于术前低水平者。由此，我们推测miRNA-155对HCC患者的预后有一定的意义，其高水平可促进HCC的发展。我们还发现，肿瘤大小、肿瘤分化和肿瘤转移等均是影响患者术后生存的独立危险因素，我们认为，这些因素对miR-155的表达可能有影响，可以进一步作深入研究。

综上所述，肝癌组织miRNA-155水平明显高于正常肝组织，且高水平的miRNA-155为HCC患者预后差的独立危险因素。肝癌组织miRNA-155水平高低可评估HCC患者的预后，是否可考虑将其作为评估HCC患者预后的独立预测因子，尚需进一步研究。

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