合欢皮总皂苷治疗旋毛虫感染小鼠的疗效观察

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旋毛虫病(trichinellosis)是由毛形线虫属旋毛虫引发的一种严重的人兽共患疾病，因生食或半生食含有旋毛虫囊包幼虫的肉类所致，旋毛虫在胃中消化释放出来，在肠道中激活[1-2]。近年来，我国旋毛虫病暴发次数增加，20世纪初中国发生了17次旋毛虫病的暴发，有828人患病，其中11人死亡[3]。

自2015年屠呦呦获得诺贝尔医学或生理学奖以来，人们对传统中药的关注度越来越高。合欢皮为《中国药典》收录的豆科植物合欢的茎皮，具有解郁安神、活血消肿功效[4]。合欢皮的成分主要包括三萜类化合物、黄酮类化合物、木质素类化合物、生物碱、多糖等。俞琦等[5]通过研究证实了合欢皮的抗炎作用，但是关于是否是合欢皮中总皂苷成分发挥作用以及是否对旋毛虫幼虫感染引起的炎症起作用却不得而知。本研究通过计数旋毛虫成虫和肌幼虫，HE染色计数囊包幼虫和免疫组化检测IL-1β，IL-6，TNF-α，COX-2的表达，对合欢皮总皂苷和阿苯达唑治疗旋毛虫感染小鼠的疗效进行观察和比较。

1 材料与方法

1.1旋毛虫来源 旋毛虫(ISS-534)虫株为猪源旋毛虫，由吉林农业大学寄生虫学教研室提供，经江苏省寄生虫病防治研究所保种传代。

1.2实验动物 6周龄的ICR雄性小鼠，体重25～30 g，清洁级，30只小鼠均由江苏省寄生虫病防治研究所提供，每只小鼠感染300条旋毛虫，实验期间自由饮水饮食。

1.3药品 阿苯达唑购自Sigma公司，药物由7%吐温80和3%乙醇溶液配制成悬液[6]，阿苯达唑的给药量为50 mg/(kg·d)[7]。

1.4合欢皮总皂苷干粉的制备 合欢皮购自无锡山禾药业集团，产地浙江。将合欢皮用粉碎机粉碎，过筛，75%乙醇加热回流2次，每次2 h，合并提取液，过滤，取滤液旋转蒸发至浸膏状，去离子水复溶，接着用水饱和正丁醇萃取4次，收集正丁醇相，旋转蒸发至干后，再次复溶，置于真空干燥箱中烘干，制得干粉并称重。合欢皮总皂苷粉末的给药量为8 mg/(kg·d)。

1.5动物分组与疗效观察 将36只感染旋毛虫的ICR小鼠随机分为6组，每组6只。组Ⅰ-Ⅲ为成虫组：组Ⅰ为感染对照组，组Ⅱ为合欢皮总皂苷治疗组，组Ⅲ为阿苯达唑治疗组；组Ⅳ-Ⅵ为肌幼虫组：组Ⅳ为感染对照组，组Ⅴ为合欢皮总皂苷治疗组，组Ⅵ为阿苯达唑治疗组。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组于感染后第2 d开始给药，连续给药3 d，于感染后第7 d处死，剖取小肠，并切成1 cm小段，取一段放入生理盐水中于37 ℃中孵育3 h，计数小肠内成虫[8]；Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组于感染后第7 d开始给药，连续给药14 d，于感染后第40 d处死，取出膈肌，其余肌肉组织绞碎，于配好的37 ℃消化液中消化2 h，全部消化后弃去上清，生理盐水清洗3次，镜下计数肌幼虫[9]。计数平均虫数和减虫率，减虫率=[(感染对照组-治疗组)/感染对照组]×100%收集Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组小鼠膈肌，固定于10%福尔马林溶液中，24 h后脱水切片(厚5 μm)，备用。

1.6HE染色计数膈肌中肌幼虫 将上述石蜡切片65 ℃烘烤1 h，二甲苯脱蜡后水化，苏木素染色5 min，自来水冲洗10 min，1%盐酸酒精分化10 s，伊红染色 3 min，二甲苯透明，中性树脂封片[10]。HE染色膈肌中肌幼虫计数方法：每只小鼠取1张组织切片，使用正置显微镜进行图像采集，每张切片随机拍摄5张视野(100×)，计数每个视野中肌幼虫数。

1.7免疫组化检测膈肌中炎症因子表达 将上述石蜡切片烘烤、脱蜡、水化，抗原修复(90-100 ℃柠檬酸溶液水浴20 min)，PBS浸洗5 min×3次，1% Triton X-100室温反应10 min，3%过氧化氢室温反应15 min，BSA溶液37 ℃封闭30 min，甩去封闭液，滴加一抗(山羊IgG)，4 ℃过夜，室温平衡30 min，PBS浸洗5 min×3次，DAB染色1～2 min，自来水冲洗，苏木素复染1 min，流水反蓝5 min，盐酸酒精分化5 s，流水反蓝7 min，中性树胶封片后镜检[11]。免疫组化阳性结果判定：IL-1β胞浆呈棕黄色色斑或颗粒[11]，IL-6胞浆呈棕黄色染色[12]，TNF-α胞浆呈棕黄(褐)色染色[13]，COX-2胞浆呈棕色或深棕色[14]。免疫组化分析膈肌中炎症因子平均光密度的方法：每只小鼠取1张组织切片，使用正置显微镜进行图像采集，每张切片随机拍摄5张视野(400×)，用IMAGE-PRO PLUS 6.0软件分析各免疫因子平均光密度值。

2 结 果

2.1合欢皮总皂苷对旋毛虫成虫和幼虫的影响 给药期间，各组小鼠均正常生长，饮水饮食正常。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组中可以明显看出，合欢皮总皂苷和阿苯达唑治疗组的成虫数较未给药组均明显减少，减虫率分别为70.34%和80.02%；从Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组可以看出给予合欢皮总皂苷和阿苯达唑之后，囊包幼虫较未给药组也明显减少，减虫率分别为65.60%和90.66% 。各治疗组的减虫率与感染对照组比较差异均有统计学意义(P<0.01)，两组治疗组比较差异有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 计数感染对照组和给药组旋毛虫成虫和幼虫数
Tab.1 Trichinella spiralis adult and total larval counts in the control and drug-treated groups

组别Studiedgroups旋毛虫成虫计数T．spiralisadultcount旋毛虫幼虫计数T．spiralislarvaecountx±sPEfficacy(%reduction)x±sPEfficacy(%reduction)感染对照组Infectedandnon⁃treated193±1146，177±3675合欢皮总皂苷组Albiziajulibrissintotalsaponins55±80．000∗∗a71．6015，838±9950．000∗∗a65．70阿苯达唑组Albendazole36±90．000∗∗81．244，644±10400．000∗∗89．94

注：与感染对照组相比，**P<0.01；与阿苯达唑组相比，aP<0.05

Note: compared with infected control, **P<0.01; compared with albendazole-treated group,aP<0.05

2.2小鼠膈肌HE染色分析 HE染色可见(图1)，感染对照组膈肌中有大量的囊包幼虫且幼虫周围有大量炎症细胞，肌纤维出现退化；而给予合欢皮总皂苷和阿苯达唑治疗后，肌纤维退化出现明显好转，且囊包幼虫数和炎症细胞都有明显减少。分析膈肌中幼虫得出合欢皮总皂苷和阿苯达唑治疗组的减虫率分别为71.19%和89.83%，各治疗组减虫率与感染对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)，两组治疗组比较差异有统计学意义(P<0.05)(表2)。

表2 小鼠感染旋毛虫后膈肌虫荷的变化
Tab.2 Changes of larval burden in the diaphragm of mice after T.spiralis Infection

组别Studiedgroups囊包幼虫计数Encystedlarvaecountx±sPEfficacy(%reduction)感染对照组Infectedandnontreated9±2合欢皮总皂苷组Albiziajulibrissintotalsaponins3±10．000∗∗a71．19阿苯达唑组Albendazole1±10．000∗∗89．83

注：与感染对照组相比，**P<0.01；与阿苯达唑组相比，aP<0.05

Note: compared with infected control, **P<0.01; compared with albendazole-treated group,aP<0.05

图1 小鼠感染旋毛虫后膈肌虫荷的变化Fig.1 Changes of larval burden in the diaphragm of mice after T.spiralis Infection

2.3 免疫组化分析

2.3.1小鼠膈肌IL-1β、IL-6、TNF-α的表达 各组小鼠炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α表达如下图(图2)。感染对照组小鼠各炎症因子的表达明显高于各给药组，两组治疗组比较差异无统计学意义(P>0.05)(表3)。

图2 小鼠感染旋毛虫后炎症因子的变化Fig.2 Changes of inflammatory factors in mice after T.spiralis Infection

分组StudiedgroupsIL⁃1βIL⁃6TNF⁃αCOX⁃2感染对照组Infectedandnontreated71．60±24．82118．13±12．52166．87±64．37117．13±7．58合欢皮总皂苷组Albiziajulibrissintotalsaponins20．10±10．63∗29．72±10．60∗∗19．14±11．45∗45．72±12．40∗∗阿苯达唑组Albendazole17．94±1．62∗17．08±5．76∗∗10．07±2．23∗36．80±17．12∗∗

注：与感染对照组相比，*P<0.05；与感染对照组相比，**P<0.01

Note: compared with infected control, *P<0.05; compared with infected control, **P<0.01

2.3.2小鼠膈肌COX-2的表达 各组小鼠COX-2的表达如图所示(图3)。给予合欢皮总皂苷和阿苯达唑之后都会降低COX-2的表达，两组治疗组比较差异无统计学意义(P>0.05)(表3)。

图3 小鼠感染旋毛虫后COX-2的变化Fig.3 Changes of COX-2 in mice after T.spiralis Infection

2.3.3小鼠膈肌IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2表达平均光密度的改变 详细结果见表3。

3 讨 论

中药是中华民族的瑰宝，是我国传统医药文化的宝贵财富。合欢皮总皂苷作为传统中药合欢皮的主要成分之一，具有安全、低毒等优点，迄今为止未见有关该药对旋毛虫的作用的报道。本研究以小鼠为研究动物模型，观察感染后7 d(肠道期)和40 d(肌肉期)时药物对旋毛虫的治疗效果，结果发现合欢皮总皂苷和阿苯达唑对肠道内成虫和肌肉内幼虫均有较好的疗效，合欢皮总皂苷对成虫和幼虫的减虫率分别为71.60%和65.70%。阿苯达唑对成虫和幼虫的减虫率分别为81.24%和89.94%。虽然合欢皮总皂苷组的效果略次于阿苯达唑组，差异有统计学意义，但是其使用剂量明显低于阿苯达唑。众多文献中均已指出阿苯达唑对旋毛虫感染各期均有较好的治疗作用[15-16]。

宿主感染旋毛虫后会产生相应的免疫反应，产生大量的单核因子，例如IL-1β、IL-6、TNF-α等。IL-1β是一种重要的免疫调节因子，细胞损伤或应对一些危险信号时起关键作用[17]。TNF-α是一种强效促炎因子，它以多效性方式对多种细胞起生物学作用，并且在慢性炎症的发病机理中发挥关键作用[18]。很多证据表明，旋毛虫感染后宿主肌肉内各种炎症介质会过度表达，继而引起肌炎等炎症相关的疾病的发生。本研究采用免疫组化方法检测旋毛虫感染小鼠合欢皮总皂苷和阿苯达唑治疗后小鼠肌肉中IL-1β、IL-6、TNF-α的水平，结果显示两组给药组肌肉中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达明显低于感染对照组，并且两组治疗组比较差异无统计学意义。

COX-2作为调节前列腺素和凝血恶烷产生的酶，其产量增多可引起疼痛和炎症反应[19]。本研究发现两组给药组同样可以减少COX-2的表达，且效果十分显著。综上所述，中药合欢皮总皂苷具有抗小鼠旋毛虫感染的作用，并且合欢皮总皂苷可调节宿主的免疫反应，减轻炎症相关疾病的发生，其效果可与阿苯达唑比拟，但其具体机制仍有待进一步研究。

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