针刀干预对大鼠股内侧肌触发点肌组织内P物质和降钙素基因相关肽表达的影响*

陈 晨，张 义，郭长青△，姚书明

(1．北京中医药大学，北京 100029；2.青岛国风药业股份有限公司，山东 青岛 266000)

肌筋膜疼痛触发点(MTrP)，是一个在患者受累骨骼肌上能够激惹疼痛的局限区域，通常可在这个位置上触摸到一个紧张性的带状条索或结节，当MTrP活化时，引起局部区域疼痛，或者诱发出牵涉痛、颤搐反应，并能引起交感现象[1]。据美国疼痛治疗中心研究发现， 85%的疼痛门诊患者均涉及到肌筋膜疼痛触发点[2]。当前，随着计算机的普及，MTrP造成的慢性疼痛人数更是逐年增高。

相关研究表明[3]，MTrP局部肌肉组织处于缺氧和高代谢状态，导致局部降钙素基因相关肽(Calcitonin gene-related peptide，CGRP)和P物质(Substance P，SP)的释放，这些致敏物质刺激传入神经末梢，引发触发点疼痛，同时交感神经受到刺激引起交感现象。

针刀疗法目前是疼痛医学领域的热点，它在综合了中医经络理论和西医解剖学理论的基础上，将中医针刺疗法和西医手术疗法有机的结合起来而形成的新型疗法，近年来常被用于治疗MTrP，其效果也十分显著[4-5]。但是其作用机制尚未完全明确。本研究以注射利多卡因为参照，通过针刀对股内侧肌筋膜疼痛触发点大鼠模型的干预及治疗，探讨不同的干预手段对肌筋膜疼痛触发点模型大鼠肌组织内的CGRP和SP表达水平的影响,为针刀临床治疗本病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级SD大鼠64只,雄性，体质量(490±10)g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物生产许可证编号：SCXK(京)2015-0021。先于实验室适应性饲养1周。

1.2 主要试剂及仪器

二抗及DAB(丹麦DAK0公司)；针刀(0.4 mm×40 mm，北京卓越华友医疗器械有限公司)；Olympus bx51显微镜(美国奥林帕斯公司)；DSPT-208大鼠跑台(杭州立泰科技有限公司)；自制打击器(总质量为1 200 g，自由下落高度是20 cm，动能为2.352 J)；Leica ST5020莱卡全自动组织脱水机(均为德国莱卡公司)；肌电仪(Z2J-MB-NCC08，上海诺诚公司)；Leica RM2235组织切片机;生物组织包埋机(TB-718，日本樱花公司)；Leica HI1220烤片机，Anymicro DSSTM图像采集系统(江苏琅珈科技有限公司)。

1.3 动物分组与造模

对64只成年雄性健康SD大鼠，采用随机数字表法将其分为4组，注射组、针刀组、空白组和模型组，每组各16只。采用“打击结合离心运动法”[6]建立肌肉触发点动物模型。在造模前禁食12 h，先将大鼠用10%水合氯醛(0.35 mL/100 g)进行腹腔注射麻醉，选取大鼠股内侧肌偏近侧端作一标记，之后将大鼠固定在鼠板上，并放置于打击器下，将打击锤对准打击标记位置后，抬高到20 cm高度，释放打击锤打击大鼠股内侧标记部位。次日将大鼠放置于电动跑台上，速度逐渐增加至16 m/min，进行90 min的-16°的下坡跑运动。实验人员用小棒驱赶大鼠，以保证大鼠进行持续下坡跑运动。每周行1次造模，共持续8周。

造模结束后喂养1周，各组均随机选取8只大鼠予以局部解剖，备皮，暴露股内侧肌，用指腹仔细搜寻紧张带上的触发点,以检测造模是否成功。

1.4 各组干预方法

空白组、模型组于造模后行常规喂养，不进行干预；注射组、针刀组干预一周1次，共3次。干预方法如下：针刀组：备皮，碘伏局部消毒，在股内侧肌用指腹仔细搜寻触发点，选用0.4 mm×40 mm针刀，刀口线与股内侧肌肌纤维方向平行，针刀体与皮肤垂直，刺入紧张带，纵向切开触发点2刀后出刀，并加压止血;注射组：备皮，碘伏局部消毒，在股内侧肌用指腹仔细搜寻触发点，用1 mL注射器向触发点内注射0.5 mL的1%利多卡因。

1.5 处理与取材

第3次干预后1周取材，以10%水合氯醛腹腔麻醉。使大鼠处于深麻醉状态后，将其固定于手术台上，去皮，剪去筋膜使左侧股内侧肌充分暴露，用食指的指腹在打击部位外的股内侧肌及附近轻轻按压，寻找收缩结节或紧张带。组织取材时，使用锋利刀片将标记的触发点处组织(0.6 cm×0.6 cm)在不挤压牵拉组织的情况下快速取出，放入4% 多聚甲醛溶液中后固定24 h。取材结束后，为了减少大鼠痛苦，给予大鼠空气栓塞法安乐死。

1.6 指标检测与观察

1.6.1 紧张带、肌电图、局部抽搐反应检查 ①对大鼠股内侧肌进行检查，若触及到紧张带以及结节条索状物为紧张带阳性；②在大鼠紧张带处进行肌电图测试，将无刺激情况下电位持续大于30 s的作为阳性；③对紧张带处进行适当刺激，若能引出局部肌肉抽搐为阳性。最后统计各组阳性率，若3项检查阳性率均高于85%则表明造模成功[3]。

1.6.2 HE染色 将各组大鼠触发点肌组织浸泡固定后，石蜡包埋，切片，切片厚度为5 μm，脱蜡，染色。常规脱水，中性树脂封片，光学显微镜下观察肌肉组织的病理改变。

1.6.3 P物质与降钙素基因相关肽免疫组化检测 采用免疫组织化学染色(即用型二步法):将已固定的肌组织标本经脱水、浸蜡、包埋、切片，厚度40 μm，置入95%酒精固定；0.01 mol·L-1PBS(PH值7.4)漂洗，吹干；3%H2O2室温封闭10 min，再用0.01 mol·L-1PBS漂洗3次；滴加一抗，4℃保存一夜；第2日取出切片，放置30 min待温度至常温后，用PBS溶液漂洗3次;滴加二抗，室温孵育30 min；0.01 mol· L-1PBS漂洗3次，然后用DAB成色，用蒸馏水反复冲洗，苏木素复染，盐酸酒精分化，氨水返蓝。脱水、透明、封片后于高倍镜下拍摄3个视野，并应用Anymicro DSSTM系统对图像进行采集分析，所得数据作免疫组织化学染色阳性信号累积光密度(IOD)，以IOD值作为组织表达的定量标准。IOD=平均光密度×阳性面积。

1.7 统计学方法

2 结果

2.1 紧张带、肌电图、局部抽搐反应检查结果

见表1、图1。由表1可见，模型组、针刀组、注射组3项检查阳性率显著高于空白组(P<0.05)，提示造模成功。由图1紧张带或膨大结节处肌电图显示为持续性反复的发电现象，其时间一般维持在30 s到10 min内左右；空白组肌电图则无反复的发电现象。

图1 空白组、紧张带或膨大结节处肌电图

组别只数紧张带肌电图局部抽搐反应空白组80(0)0(0)0(0)模型组87(87．5)∗7(87．5)∗7(87．5)∗针刀组88(100)∗7(87．5)∗7(87．5)∗注射组87(87．5)∗8(100)∗7(87．5)∗

注：与空白组比较，*P<0.05

2.2 触发点肌组织HE染色结果

空白组肌细胞形态规则，肌纤维排列规则，肌丝粗细均匀；模型组肌纤维排列紊乱粗细不一，部分肌纤维出现萎缩或者断裂;注射组两断端的肌纤维间以少量结缔组织相连,肌纤维较成熟,肌纤维排列整齐,明暗带清晰，有新生成的毛细血管存在；针刀组新生的肌纤维与结缔组织交叉,但仍有一些肌纤维扭曲，有新生成的毛细血管。见图2。

图2 各组大鼠触发点肌组织HE染色情况

2.3 各组触发点肌组织中SP表达水平的比较

模型组SP表达水平较空白组明显升高(P<0.05);针刀组、注射组与模型组相比，SP表达水平明显下降(P<0.05)；针刀组与注射组相比，SP表达水平明显下降(P<0.05)。说明针刀干预可减少触发点处肌组织SP的表达水平。见表2和封三彩图3。

2.4 触发点肌组织中CGRP表达水平的比较

模型组CGRP表达水平较空白组明显升高(P<0.05);与模型组相比，针刀组、注射组的CGRP表达水平明显下降(P<0.05)；与注射组相比，针刀组的CGRP表达水平明显下降(P<0.05)。说明针刀干预可减少触发点处肌组织CGRP的表达水平。见表3和封三彩图4。

表2 各组大鼠触发点肌组织中SP平均光密度比较

注：与空白组比较，*P<0.05；与注射组比较,#P<0.05；与模型组比较,△P<0.05

表3 各组大鼠触发点肌组织中CGRP平均光密度比较

注：与空白组比较，*P<0.05；与模型组比较,△P<0.05;与注射组比较,#P<0.05

3 讨论

肌筋膜疼痛触发点由美国学者Janet G.Travell于1942年首先提出,发现MTrP是造成非器质性神经肌纤维疼痛综合征的的重要因素之一。目前随着社会生活压力的不断增高，电脑、手机的过度使用，工作姿势不良,运动不足等原因，以MTrP为主要特征的肌筋膜疼痛综合症的患者人数正逐年增加。肌筋膜疼痛触发点常见的临床特征为:①按压MTrP可以诱发局部疼痛和牵涉痛；②快速按压MTrP可诱发局部肌肉颤搐反应；③MTrP局部以及周围相关的肌肉紧张性增高；④存在MTrP的病人可伴有局部交感症状，表现为血管收缩、竖毛反应、异常出汗、皮肤滚动疼痛、寒冷或烧灼感、过度分泌等现象。目前，触发点注射利多卡因被广泛用于肌筋膜疼痛综合征的治疗,但是肌内局部注射利多卡因会造成肌毒性，影响患者健康[7]。

肌筋膜疼痛触发点与传统中医概念中的阿是穴有着极大的相似性。《千金要方》中提到：“有阿是之法，言人有病痛，即令捏其上，若里当其处，不问孔穴，即的便成痛处，即云阿是。” 这段文字对“以痛为腧”进行了阐释，认为软组织中可触及的疼痛性结节，可定为阿是穴，无论是否在穴位上，都可以直接针刺，这一点与MTrP表现极为相似[6]。

P物质是公认的与伤害性刺激有关的神经肽，其分布范围包括外周和中枢系统。SP与疼痛信息的传递关系密切。许多实验证明[8-9],P物质在外周组织伤害信息的生成、引起感觉神经元兴奋致痛觉过敏和伤害信号的初级传入过程均有重要作用。CGRP与SP存在协同作用，Schaible HG对CGRP与SP的关系进行了研究结果显示[10]，CGRP能抑制SP内切酶产生，SP内切酶酶可以降解SP，因此CGRP可以使SP含量增高，并向中枢释放及传递痛觉，导致疼痛发作。总之SP、CGRP的释放会使致敏传入神经，将疼痛信号传入脊髓，产生中枢疼痛信号，再扩散到邻近的脊髓节段引起牵涉痛，并引起局部交感症状。

本试验结果显示，模型组大鼠触发点肌组织内SP和CGRP的表达较正常组显著升高(P<0.05)，这表明触发点形成后，大鼠股内侧肌内SP和CGRP的释放增加。针刀及注射利多卡因干预后，SP和CGRP的表达较模型组均明显降低(P<0.05)，提示针刀及注射利多卡因干预均能减少触发点处肌SP与CGRP的释放。针刀组触发点肌组织内SP和CGRP的表达较注射组明显降低(P<0.05)，这表明针刀干预对降低肌筋膜疼痛触发点处SP和CGRP的释放效果优于局部注射利多卡因。

针刀疗法是我国中医治疗肌筋膜源性疼痛的有效方法。针刀在中医经络学和西医解剖学的基础上将中医毫针针刺和西医微创松解结合在一起，可以同时具有通筋活络以及松解、减压的双重作用。针刀疗法综合应用中医疗法与西医疗法各自的优势，既加强了针刺的感效应效果，又可以避免了西医手术的创伤，能有效地松解局部组织粘连，舒筋通络，活血止痛 ，达到良好的临床治疗效果。本实验证实针刀干预能够降低肌筋膜疼痛触发点处肌组织内SP和CGRP的表达，这可能是针刀治疗肌筋膜疼痛综合征、减轻肌筋膜疼痛触发点处疼痛和牵涉痛并改善局部交感症状的机制之一。

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