“三焦针法”对痴呆小鼠线粒体膜通道孔活性的调控及神经细胞凋亡的影响*

王 亮,邢 菁,郭睿婧,韩秀娣,付 于

(1.天津中医药大学，天津 300193；2.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001；3.天津市环湖医院，天津 300193;4.天津中医药大学第一附属医院，天津 300193)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。其主要的病理改变为选择性神经元丢失、弥漫性脑萎缩、大量老年斑、神经纤维缠结等[1]。而细胞凋亡在AD神经元丢失中有着重要影响，尤其是在大脑皮质和海马区的神经元丢失更为突出[2]。大量研究表明，线粒体功能障碍导致的细胞凋亡在AD的发病机制中有着重要作用[3]。线粒体膜通透性转换孔(mitochondria permeability transition pore，mPTP)是存在于线粒体内外膜之间的一组蛋白复合体，是一种非特异性通道。MPTP一旦形成,会导致线粒体膜电位下降、细胞色素c(Cytochrome C，Cytc)释放和轴突线粒体转运受损，最终引起线粒体功能结构崩解、AD神经元细胞死亡[4]。B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)家族蛋白广泛分布在线粒体外膜，可调节mPTP的开放和闭合，被认为是经线粒体途径调节细胞凋亡的重要蛋白[5]。

韩景献教授首创的“三焦针法”能够提高AD患者的认知功能和生活能力，是阿尔茨海默病的有效治疗手段[6]。本课题组前期研究发现，“三焦针法”能明显抑制线粒体内钙离子的蓄积，减少氧自由基的产生，说明“三焦针法”能够改善线粒体功能[7]。深入研究发现，快速老化小鼠皮质、海马线粒体中mPTP相关蛋白β-淀粉样蛋白42(β-amyloid42，Aβ42)、CypD含量升高，且“三焦针法”可下调Aβ42、CypD蛋白含量[8]，从而推测出AD发生与mPTP过度开放有关，且“三焦针法”能够调节mPTP的活性，减缓线粒体功能障碍的发生。本研究从线粒体膜通道孔开放的角度，探讨 “三焦针法”通过对Bcl-2蛋白的调控从而抑制AD细胞凋亡的部分作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物选择和分组

选用健康雄性8月龄SAMP8快速老化痴呆小鼠和SAMR1同品系正常小鼠。SAMP8型小鼠，是目前国内外公认的比较标准化的AD动物实验模型，由天津中医药大学第一附属医院老年脑病研究室动物中心提供,清洁级,合格证号:W-J津实动质M准字第006号。

小鼠随机分为SAMP8空白对照组、SAMP8非穴位针刺组、SAMP8穴位针刺组和SAMR1正常对照组(以下简称为SAMP8组、非穴组、针刺组、SAMR1组)，每组各6只(此动物数仅为1个实验指标的基本动物数)。

1.2 针刺方法

针刺组：采用“三焦针法”进行针刺，取穴为膻中、中脘、气海、双侧外关、双侧血海和双侧足三里，穴位定位参照十五规划教材《实验针灸学》。针刺方法：其中血海穴施捻转泻法30 s，其余各穴分别施捻转补法30 s。每日针刺1次，持续30天，每7天休息1次。

非穴组：取双胁下两个固定非穴位点，平补平泻手法105 s。方案同针刺组。

SAMP8组和SAMR1组:两组均不予针刺操作，只进行相同时间和程度的捉抓。

1.3 实验试剂和仪器

试剂：线粒体提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)、Janus Green B(Sigma 公司)、纯化线粒体膜通道孔荧光检测试剂盒(GENMED，美国)、原位细胞凋亡检测试剂盒(美国ROCHE公司出品)、DAB检测试剂盒(购于河北博海生物工程有限公司)，BCA试剂盒(上海生工)、Bcl-2抗体(CST，美国)、辣根酶标记山羊抗兔IgG( SP-9001，北京中杉金桥生物公司)、Western Blotting 化学发光试剂(Millipore)。

仪器：荧光分光光度计(Cary Eclipse，澳大利亚)、垂直电泳槽(DYCZ-24D, 北京六一仪器厂)、多功能真彩色细胞图象分析管理系统(美国Media Cybernetics公司，Image-Pro Plus)、针灸针(0.3 mm×40 mm，苏州)。

1.4 荧光分光光度计检测各组小鼠RFU值

小鼠皮质、海马线粒体提取：使用线粒体提取试剂盒从各组小鼠皮质、海马提取线粒体，并用0.1% Janus Green B染色鉴定，在光镜下，观察到蓝绿色圆形颗粒。将纯化好的线粒体样品用GENMED染色液染色，并用荧光分光光度计检测，读取相对荧光数值(Relative Fluorescence Units，RFU)。用RFU值代表线粒体膜通道孔的开放状态，RUF值降低表明膜通道孔活性增强，反之亦然。

1.5 Western Blot定量分析线粒体Bcl-2的含量

将线粒体分离，用BCA试剂盒检测线粒体蛋白含量；再采用Western Blot 方法定量分析，将SDS丙烯酰胺凝胶电泳，而后转移至PVDF膜上，用5%脱脂奶液封闭膜2 h后，与Bcl-2抗体孵育、再与辣根酶标记山羊抗兔IgG孵育、漂白后，用化学发光试剂显色、拍照，凝胶图像分析系统分析条带的灰度值。每组样品测3次，取均值；以β-actin为参照物。

1.6 TUNEL法检测细胞凋亡

将脑组织放入4%的多聚甲醛固定液中固定、保存。石蜡包埋、切片、脱蜡、脱水；用蛋白酶K(20 μg/mL溶于Tris/HCl中，Ph7.4～8.0)孵育。滴加50 uL的TUNEL反应混合溶液、孵育，然后在荧光镜下分析结果。加入50 uL转化剂-POD进行信号转化和分析。最后加入50～100 μL DAB底物溶液，木素复染细胞核，在光镜下图象分析。

1.7 读取各组细胞凋亡IHS评分

TUNEL法染色得到的阳性神经元，体积缩小，形态不规则，核呈棕黄色，其他细胞核为蓝色(见图3)，这一结果与其他实验研究[9]一致。每张切片选取5个高倍视野，每只小鼠共计数10个视野内阳性细胞总数染色结果用免疫组化评分(IHS)表示，IHS=A×B；A为阳性细胞百分比对应的值：阳性的细胞数<5%为0分，5～25%为1分，25～50%为2分，50～75%为3分，>75%为4分；B为阳性细胞染色强度，0～1分为不着色(-)，2～4分为浅黄色(+),5～8分为棕黄色(++),9～12分为棕褐色(+++)。

1.8 统计学方法

2 结果

2.1 各组小鼠RFU值

见表1、图1。结果显示相对于SAMR1组， SAMP8组与非穴组的RUF值明显降低，针刺组与SAMR1组没有显著差异。

表1 各组小鼠RFU值比较

图1 各组小鼠海马与皮质的RFU值比较

2.2 各组小鼠皮层、海马线粒体Bcl-2的表达及针刺效应

由图2、表2得出以下结果：皮质中：SAMP8组与SAMR1组比较，Bcl-2蛋白表达下调，有显著差异(P<0.05)；针刺组与SAMP8组比较，Bcl-2蛋白表达上调(P<0.05)，并趋向SAMR1组；非穴组与SAMP8组比较，无显著性差异(P>0.05)，与针刺组比较, Bcl-2蛋白表达下调(P<0.05)。

海马中：SAMP8组与SAMR1组比较，Bcl-2蛋白表达下调，有显著差异(P<0.05)；针刺组与SAMP8组比较，Bcl-2蛋白表达上调(P<0.05)，并趋向SAMR1组；非穴组与SAMP8组和针刺组比较, Bcl-2蛋白表达下调(P<0.05)。

图2 各组小鼠皮层、海马线粒体Bcl-2的Western-blot电泳图 注：A：SAMR1组皮质;B：SAMP8组皮质;C：针刺组皮质;D：非穴组皮质;E：SAMR1组海马;F：SAMP8组海马;G：针刺组海马;H：非穴组海马

组别皮质海马SAMR1组0．71±0．030．58±0．03SAMP8组0．49±0．09∗#0．37±0．04∗#非穴组0．42±0．10∗0．31±0．08∗针刺组0．63±0．09△0．51±0．05△

注：与SAMR1组比较，*P<0.05；与针刺组比较，#P<0.05；与非穴组比较，△P<0.05

2.3 各组细胞凋亡IHS评分

由封三彩图3、表3得出以下结果；海马：各组间IHS评分比较无明显差异，P>0.05；SAMP8组与SAMR1组的IHS评分比较，无统计学差异(P>0.05)，但有明显升高趋势；与针刺组比较，无统计学差异(P>0.05)，但有下降趋势。皮层：SAMP8组与SAMR1组的IHS评分比较，P<0.05；非穴组与SAMR1组比较，P<0.05；针刺组与非穴组比较，P<0.05；针刺组与SAMP8组比较，IHS评分无统计学差异(P>0.05)，但有明显的下降趋势；其余各组间比较无统计学差异，P>0.05。

表3 各组细胞凋亡IHS值比较

注：与SAMR1组比较，*P<0.05；与非穴组比较，▼P<0.05

3 讨论

“三焦针法”主要是从调理三焦气化能够延缓衰老和防治老年病的角度所创立的，通过针刺膻中、中脘、气海、血海和足三里诸穴来调节上、中、下三焦之气。老年性痴呆是伴随衰老出现的最常见疾病之一，祖国医学认为该病属于癫狂、痴呆范畴，病位在脑，与三焦气化功能失常有关。《圣济总录·三焦门·三焦统论》所言“三焦有名无形，主持诸气”，三焦是气的升降出入的通道，又是气化的场所，故具有总司全身气机和气化的功能。《难经》中记载：“三焦者，元气之别使也，主通行三气，经历五脏六腑”，充分说明了人体的气历经三焦这个通道而输布到五脏六腑，以维持人体正常生命活动。三焦气化功能异常，气血津液升降出入通道不畅，导致内生风、火、湿、热诸邪及痰浊、血淤、浊毒等病理产物。由此韩景献教授认为老年性痴呆症是由于正常的衰老导致三焦气化失常，因而气血津液衰败，痰瘀浊毒滋生，致阴阳失调。故而选穴膻中、中脘、气海、血海、足三里以维持上焦如雾、中焦如沤、下焦如渎的状态[10-11]。而且近来实验研究表明“三焦针法”通过改善脑内能量代谢、纠正衰老相关基因与蛋白的异常表达、修复神经元损伤、清除氧自由基来治疗AD，及通过改善脑内总胆固醇水平和影响神经递质来改善AD患者的认知功能[12-13]。因此，“三焦针法”是治疗AD的一种有效方法。

mPTP开放会造成包括辅因子和离子在内的所有小型电解质平衡跨越线粒体膜，导致线粒体和细胞质之间的代谢梯度被破坏，而且释放出累积的钙致使线粒体渗透膨胀，线粒体膜电位的消散以及线粒体呼吸链的损伤，从而减少线粒体氧化磷酸化过程,进而导致三磷酸腺苷产生减少和活性氧生成增加，因此大量的mPTP形成可致线粒体损伤和细胞凋亡[4,14]。mPTP开放改变了线粒体结构和功能，这对与衰老有关的神经元损伤方面起着中枢作用。通过荧光分光光度计检测线粒体膜通道孔的开放状态发现，SAMP8组小鼠皮层和海马的mPTP活性高于SAMR1组；而针刺后，其mPTP活性明显降低，说明“三焦针法”能够抑制mPTP活性，这与课题组前期实验结果相一致[8]。

而mPTP开放促使游离的B细胞淋巴瘤因子相关X蛋白(Bax)位移、结合Bcl-2，从而阻止Bcl-2蛋白激活，促进细胞凋亡[15]。而且Bcl-2蛋白对正常细胞的自身稳定性起重要作用，其高表达可以调控mPTP开放所释放的Cytc，抑制神经元凋亡[5]。因此针对Bcl-2蛋白继续研究，实验中SAMP8组小鼠的线粒体Bcl-2蛋白显著下调，而针刺后Bcl-2蛋白上调，且趋向SAMR1组。由此，可说明“三焦针法”通过上调SAMP8组小鼠中低表达的Bcl-2蛋白，从而抑制mPTP活性、阻止mPTP开放。有实验表明针刺可下调Bax蛋白表达量、 增加Bcl-2蛋白进而抑制细胞凋亡，推测与针刺调控mPTP活性有关，这也与实验结果大体一致[16]。

采取TUNEL法检测小鼠大脑神经元细胞凋亡情况，其结果显示SAMP8组小鼠海马、皮层较SAMR1组相比，IHS评分有明显升高趋势，说明AD的发生确实与细胞凋亡过度有关。而针刺组小鼠海马、皮层细胞凋亡IHS评分较SAMP8组有明显下降，证明“三焦针法”能够抑制过度的细胞凋亡。综上可说明“三焦针法”通过上调Bcl-2蛋白表达、抑制mPTP活性从而阻止mPTP开放，最终达到抑制AD细胞凋亡的目的。

本研究发现非穴位组虽可降低小鼠mPTP活性，但效果明显低于针刺组，说明腧穴是具有特异性的，同时也证明了“三焦针法”的优越性。此外，仅从本研究只能够说明三焦针法可以改善AD细胞凋亡情况，因此笔者将进一步研究，以期更全方位深层次探究“三焦针法”在AD细胞凋亡中的作用。

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