寒凝血瘀型子宫内膜异位症大鼠模型的制备

丛慧芳，谷栩萌，张天婵，刘彤彤，刘宴君，高强，武文鹏*

(1.黑龙江中医药大学附属第二医院，黑龙江 哈尔滨 150001； 2.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

子宫内膜异位症(EMs)是子宫内膜组织(腺体和间质)出现在子宫体以外的部位[1]。它是妇科临床中的常见病、疑难病。其最主要的临床表现是继发性痛经及不孕，无论何种表现都严重威胁了广大育龄女性的身心健康，故针对子宫内膜异位症的病因病机及治疗研究已成为医学界的重要课题，因此制备与临床患者相近的动物模型极为重要。导师丛慧芳教授从“伏寒伤肾，致瘀损络”[2]这一理论认识子宫内膜异位症，阐述了本病的发病原因及疾病表现，本课题组结合临床患者实际患病过程，将前人造模方法改良，采取冰水浸泡加药物法，先建立寒凝血瘀动物模型，再采取自体子宫内膜移植加冰水浸泡法，建立病症结合的寒凝血瘀型子宫内膜异位症模型，意在为子宫内膜异位症的研究做微薄力量。

1 材料和方法

1.1 实验动物

6周龄健康的SPF级雌性SD大鼠，体质量(200±10)g，购自黑龙江中医药大学实验动物中心，动物生产许可证号：SCXK(辽)2015-0003。将大鼠饲养于黑龙江中医药大学中医药研究院实验室2周后再给予造模，室内温度(22±2)℃，相对湿度45%～55%，每日光照12 h，自由饮食、饮水，使所有大鼠处于同样的环境下并适应该饲养环境。

1.2 主要试剂、耗材与仪器

盐酸肾上腺素(遂成药业股份有限公司，批号：1611251);苯甲酸雌二醇注射液(四川金科药业有限公司，批号：220412511);10%水合氯醛注射液，碘伏消毒液(上海利康消毒高科技有限公司，批号：20161115);0.9%氯化钠注射液(华仁药业有限责任公司，批号：H51023935);硫酸庆大霉素注射液(林州市亚神制药有限公司，批号：H41022646);10%甲醛溶液;石蜡(上海华永石蜡有限公司);二甲苯(北京益利精细化学品有限公司);中性树脂(国药集团化学试剂有限公司);无水乙醇(北京化工厂);苏木素伊红(HE)染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)。

一次性使用血样采血针;肝素钠NH真空采血管;枸橼酸钠1∶9真空采血管;1 mL和5 mL注射器;普通眼科手术器械。

南京志伦全自动血流变测试仪;SYSMEX全自动血液凝固仪德国Leica ASP300全自动脱水机;RM2135型切片机;上海一恒电热恒温箱;-80 ℃低温冰箱。

1.3 实验动物分组

1.3.1 寒凝血瘀型大鼠模型的制备

选取SD大鼠24只，随机分为冰水浴7 d组8只，冰水浴14 d组8只，空白对照组8只。

1.3.2 寒凝血瘀型子宫内膜异位症大鼠模型的制备

根据造模时间，将大鼠分为空白对照组、术后3 d组、术后5 d组、术后1周组、术后2周组、术后3周组、术后4周组、术后6周组、术后8周组及术后12周组。

1.4 动物模型制备

1.4.1 寒凝血瘀型大鼠模型的制备

SPF级SD大鼠适应性喂养2周后，每日上午9点置于0～1 ℃冰水混合物中浸泡8 min，当大鼠出现反应迟钝、腿部僵直欲沉或呼吸微弱时取出，每日1次，冰水中捞出后迅速用干毛巾擦拭，同时电动吹风机吹至干爽，注意保温。分别于冰水浴7 d及14 d当天，皮下注射0.1%盐酸肾上腺素0.8 mg/kg，共两次，间隔4 h，2次之间将大鼠置于0～1 ℃冰水中浸泡5 min，末次造模后12 h内禁食不禁水。第二日观察大鼠的耳、舌及舌下脉络，并于麻醉状态下，开胸，充分暴露大鼠心脏，采血针刺入心尖，另一端插入真空管，取4 mL血注入肝素钠NH真空采血管；取2 mL血注入枸橼酸钠1∶9真空采血管，分别于全自动血流变测试仪及全自动血液凝固仪行血流变及凝血功能检测，以确定大鼠寒凝血瘀模型建立成功的时间。

1.4.2 寒凝血瘀型子宫内膜异位症大鼠模型的制备

取76只健康6周龄SPF级雌性SD大鼠适应性喂养两周后，行冰水浴2周后给予肾上腺素注射(具体方法同前)，冰水浴期间，每日8时给大鼠行阴道涂片检查，以观察大鼠的动情周期，选择出现至少2个连续且规律的动情周期的大鼠，冰水浴满2周后，择动情期，采用经典的手术方法对大鼠子宫内膜进行移植，按孙博[3-4]等人。

空白对照组大鼠为假手术，仅开腹找到子宫，再用生理盐水冲洗腹腔，最后缝合腹壁。术后给予每只大鼠硫酸庆大霉素注射液腹腔注射0.1 mL/d，连续3 d，各模型组每只大鼠皮下注射苯甲酸雌二醇注射液0.1 mL/(kg·d)，连续3 d。所有大鼠正常清洁饲养，并于手术1周后，将缝合刀口处贴医用防水胶布，于每日上午9时置于0～1 ℃冰水混合物中浸泡8 min，日1次，连续1周，每次水中捞出后毛巾擦拭，同时电动吹风机吹至干爽，注意保温。大鼠实验过程中，溺水死亡2只，麻醉后死亡1只，术中死亡1只，术后感染死亡1只，术后伤口咬开后死亡4只。余大鼠分别于术后3 d、5 d、1周、2周、3周、4周、6周、8周、12周，选取6只大鼠。于麻醉状态下，采血行血流变及凝血功能检测(采血方法同前)。取血完毕后开腹，找到移植病灶处，行大体外观观察，各手术组大鼠取异位内膜连同下方肌层约0.5 cm×0.5 cm的组织，空白对照组大鼠取子宫段0.5 cm，从中间剪开，分别放在10%甲醛溶液中保存，以行病理学观察。

1.5 成模标准

1.5.1 寒凝血瘀型大鼠模型成模标准

(1)中医证候：大鼠出现畏寒喜暖，背弓毛枯，蜷缩少动，食少便溏，爪甲、耳缘紫暗、舌质紫暗、舌下脉络增粗色暗等寒凝血瘀证的症状[5]。(2)实验室指标：血流变和凝血功能检查有相应变化[6]。

1.5.2 寒凝血瘀型子宫内膜异位症大鼠模型成模标准

(1)具备上述寒凝血瘀证的证候表现及实验室指标；(2)肉眼观察移植物呈囊泡样结构，囊泡内含淡黄色清亮的或咖啡色的液体，囊泡表面及周围可见血管形成；(3)病理学观察：异位组织可见明显的子宫内膜上皮及基质，层次清晰，表面上皮呈柱状，基质呈少许纤维化，可见多量微血管形成[7]。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 寒凝血瘀型大鼠模型的实验结果

2.1.1 大鼠造模不同时间的中医证候表现

本实验采用冰水浸泡加皮下注射盐酸肾上腺素法制备寒凝血瘀型大鼠。空白对照组大鼠精神状态良好，反应敏捷，饮食及二便正常，皮毛紧贴于身体并且有光泽感，耳廓血管清晰无增粗且颜色鲜红，舌质粉红，舌下脉络细小且颜色无加深；冰水浴7 d组大鼠出现畏寒、饮水增多等表寒证；冰水浴14天组大鼠出现畏寒喜暖，背弓毛枯，蜷缩少动，食少便溏，爪甲、耳缘紫暗，舌质紫暗，舌下脉络增粗且色暗等寒凝血瘀证症状。

2.1.2 各组大鼠实验室指标变化

2.1.2.1 出凝血时间

冰水浴7 d组、冰水浴14 d组的凝血酶原时间(PT)、国际标准化比值(PT-INR)、部分凝血活酶时间(TT)均明显低于空白对照组；纤维蛋白原(FIB)明显高于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。(见表1)

表1 各组大鼠的出凝血时间比较

注：与空白组比较，*P<0.05

2.1.2.2 血流变

冰水浴7天组、冰水浴14天组的低切、中切、高切、血浆黏度、全血黏度、红细胞聚集指数、全血相对指数(低切)、全血相对指数(高切)均明显高于空白对照组，差异均有统计学意义(P<0.05)。冰水浴14天组与冰水浴7天组比较，低切、高切、血浆黏度均高于冰水浴7天组，差异均有统计学意义(P<0.05)；二者比较，中切、全血黏度、红细胞聚集指数、全血相对指数(低切)及全血相对指数(高切)，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2～3。

表2 各组大鼠的血流变—血浆黏度比较

注：与空白组比较，*P<0.05；与冰水浴7天组比较，#P<0.05

表3 各组大鼠的血流变—红细胞系列比较

注：与空白组比较，*P<0.05

2.2 寒凝血瘀型子宫内膜异位症大鼠模型的实验结果

2.2.1 大鼠造模情况

本课题组选用冰水浸泡加皮下注射肾上腺素法建立寒凝血瘀大鼠模型，随后采用自体子宫内膜移植加冰水浸泡的方法建立病证结合的寒凝血瘀型EMs大鼠模型。本次参加造模大鼠为70只，除造模过程中死亡者，余62只大鼠，腹壁出现脓包2只，病灶曾黄色纤维素样3只；腹壁出现瘀血块2只，此次造模共成功55只，造模成功率78.6%。

2.2.2 各组大鼠中医证候表现

除术后12周组外，各模型组大鼠皆出现了前文描述的寒凝血瘀的中医症候表现；术后12周组大鼠精神状态尚可，皮毛缺少光泽，耳廓周围血管清晰但颜色暗红，舌黯、舌下脉络颜色略深；空白对照组大鼠精神状态良好，反应敏捷，饮食及二便正常，皮毛紧贴身体且有光泽，耳廓周围血管清晰无增粗且颜色鲜红，舌质粉红，舌下脉络细小且颜色不深。

2.2.3 各组大鼠病灶大体外观

分别于术后3 d、5 d、1周、2周、3周、4周、6周、8周及12周对大鼠子宫内膜移植处进行大体观察，术后3 d移植物与移植部位可见部分融合；术后5 天可见二者完全融合，病灶周围有炎性反应，病灶表面可见新生血管；术后1周与术后5 d基本无差别；术后2周移植物体积增大；术后3周与术后2周相比移植物体积增近囊泡样，其内可见透明或淡黄色液体；术后4周与术后2周相比移植物体积明显增大且呈囊泡状，表面可见清晰血管，囊泡内可见淡黄色或咖啡色液体，部分移植物与周围组织粘连；术后6周与术后4周比较无明显差异，个别病灶可见体积略赠大，囊泡内液体较浑浊，表面血管增多，与周围组织粘连情况无变化；术后8周与术后6周相比，肉眼观察无明显区别，偶见个别病灶缩小；术后12周与术后8周比，肉眼观察无明显区别，个别病灶颜色加深或缩小。见图1。

图1 各组大鼠病灶大体外观

2.2.4 各组大鼠病灶的病理观察

空白对照组，子宫内膜的结构完整，上皮细胞整齐连续，呈长柱状排列，可见多量间质细胞，腺体和血管丰富；术后3天，组织严重水肿，间质细胞少，仅见炎性细胞散在于间质中；术后5天，异位组织还未形成完整内膜上皮结构，间质细胞相对增多，以炎细胞为主，可见毛细血管增生，但间质结构较松散，与术后3天比较，组织水肿减轻；术后1周，异位组织形成完整的内膜上皮结构，见大量炎细胞，可见结缔组织增生，组织水肿明显减轻；术后2周，内膜腺体形成，炎细胞明显减少，水肿进一步减轻，结缔组织增生；术后3周，接近正常的子宫内膜组织形态，炎细胞减少，水肿消失；术后4周，移植物已经形成典型的子宫内膜组织形态，内膜上皮细胞呈柱状排列，偶有假复层结构，但与正常的子宫内膜相比较，间质细胞及腺体数量增多，腺上皮呈立方排列，且血管丰富；术后6周与术后4周比较，上皮细胞排列更为紧密，间质致密，细胞数量更多；术后8周，异位组织结构与术后6周相似，上皮细胞呈柱状生长，间质细胞和腺体数量基本无变化，血供丰富；术后12周：与术后8周比较无明显变化，仍具有典型的子宫内膜组织形态，偶见疏松结缔组织。见图2。

2.2.5 各组大鼠的实验室指标变化

2.2.5.1 出凝血时间

各组出凝血时间情况，除术后12周组，其余各组与空白组比较，出凝血酶原时间、国际标准化比值及部分凝血活酶时间均明显下降，纤维蛋白原明显升高，差异均有统计学意义(P<0.05)；术后12周组与空白组比较，出凝血酶原时间、国际标准化比值均升高，差异有统计学意义(P<0.05)；部分凝血活酶时间及纤维蛋白原均无明显差异，无统计学意义(P>0.05)(见表4)。

图2 大鼠病灶的病理观察(HE×200)

组别n凝血酶原时间(PT)国际标准化值(PT-INR)部分凝血活酶时间(TT)纤维蛋白原(FIB)空白组613．46±0．521．14±0．5122．49±0．771．56±0．10术后3d组67．83±0．44∗0．67±0．03∗15．07±0．42∗1．85±0．06∗术后5d组68．03±0．23∗0．69±0．02∗14．90±0．24∗1．86±0．05∗术后1周组67．83±0．52∗0．67±0．01∗14．90±0．09∗1．87±0．04∗术后2周组67．70±0．89∗0．65±0．18∗14．63±0．21∗1．89±0．05∗术后3周组68．30±0．39∗0．71±0．32∗15．13±0．05∗1．90±0．03∗术后4周组67．81±0．13∗0．67±0．11∗15．10±0．17∗1．93±0．13∗术后6周组68．00±0．19∗0．70±0．03∗14．87±0．21∗2．02±0．18∗术后8周组67．99±0．47∗0．68±0．04∗15．52±0．64∗1．96±0．02∗术后12周组614．12±0．94∗1．22±0．13∗22．7±1．081．64±0．04

注：与空白组比较，*P<0.05

2.2.5.2 血流变

各组血流变情况，除术后12周组，其余各组与空白组比较，各项指标均明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；术后12周组与空白组比较，低切、中切、高切、血浆黏度及红细胞聚集指数差异无统计学意义(P>0.05)；全血相对指数(低切)及全血相对指数(高切)下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见表5～6。

表5 各组大鼠的血流变—血浆粘度比较

注：与空白组比较，*P<0.05

表6 各组大鼠的血流变—红细胞系列比较

注：与空白组比较，*P<0.05

2.3 结论

综合各组大鼠的中医证候、出凝血时间及血流变发现，冰水浴2周+盐酸肾上腺素皮下注射，可以成功制备寒凝血瘀型大鼠模型。

根据上述病理结果，结合实验室指标，我们发现术后4周组可以作为寒凝血瘀型子宫内膜异位症的动物模型，同时该模型具有稳定性，其稳定性至少可以持续到术后8周，术后12周虽无寒凝血瘀证的表征，但异位病灶确持续存在。

3 讨论

中医动物模型是在中医理论的指导下，对人类疾病的某些特征进行复制或模拟，来制备的符合人类疾病和证的实验动物模型[6]。本课题团队查阅相关文献[8-9]并结合地域性，提出了寒凝血瘀型为子宫内膜异位症的主要证型，导师丛慧芳教授针对此证型首创“伏寒伤肾，致瘀损络”[2]这一理论，从中医角度解释了本病的发病原因及疾病表现。本课题针对本病的发生发展，模拟人类发病过程，进行大鼠模型的建立。临床子宫内膜异位症患者患病具有隐匿性及潜伏性，在青少年中，该病从出现临床症状到确诊，一般需要(2.96±2.93)年[10]，而在生育年龄妇女一般需要8～11年[11]，故患者通常是先有临床症状，随后数年经超声或腹腔镜下证实患有子宫内膜异位症，也就是说患者存在寒凝血瘀证的证候表象后，逐渐自我积聚，日益而成子宫内膜异位症。故本课题模拟疾病发生发展的过程，先建立寒凝血瘀证大鼠模型，在寒凝血瘀大鼠模型的基础上，建立子宫内膜异位症模型，更符合本病的病机演变规律。为了使证型更稳定，故术后1周后，再次将大鼠冰水浸泡1周，也与临床患者体内持续存在寒凝血瘀之病因相符合。

对于寒凝血瘀模型建立，冰水浸泡持续时间的选择，多篇文献[12-13]提示冰水浸泡2周后，证型最稳定，可以用于寒凝血瘀证的研究，本课题组实验结果与前人所述一致，故冰水浸泡时间持续2周。

寒凝血瘀模型建立时，对于肾上腺素的应用问题的考虑，部分学者[4,14]单纯采用冰水浸泡法建立寒凝血瘀模型，部分学者[5,15]采用冰水浸泡加皮下注射肾上腺素法。本课题组考虑，用冰水浸泡的方法刺激大鼠，兴奋了大鼠的交感神经，反射性的引起血管收缩，使大鼠生理功能出现代偿性增强，出现表寒发热的代谢亢进的症状，如寒战发热，饮水增多等，随着冰水浸泡的持续，到第2周机体处于失代偿状态，表现为倦怠蜷缩，背弓毛枯，寒战，不发热，严重者反应迟钝，呼吸微弱。因为持续的寒冷刺激使机体发生微循环障碍，此时结合盐酸肾上腺素皮下注射，诱导了血小板及红细胞聚集,使血液的凝聚状态加剧。本方法是在中医“寒邪致瘀”的病因病机基础上，结合血瘀的病理生理改变而设，故采用冰水浸泡加皮下注射肾上腺素法造模可以使该模型更稳定。

本课题创新点：模拟临床子宫内膜异位症患者疾病发生发展过程，先造成寒凝血瘀模型，再手术自体移植子宫内膜组织；寒凝血瘀模型的建立采用了冰水浸泡加皮下注射肾上腺素法；移植后，分别于3 d、5 d、1周、2周、3周、4周、6周、8周、12周动态观察大鼠移植病灶大体情况、病理变化及实验室指标变化情况，对寒凝血瘀型子宫内膜异位症大鼠模型的演变做动态记录。本课题为子宫内膜异位症的动物研究提供了实际且可靠的造模方式及造模时间，为病证结合的子宫内膜异位症造模提供了新方法。

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