熄风胶囊对匹罗卡品IE大鼠血液及脑细胞外 液卡马西平药物浓度影响的实验研究

吴超，李新民，张喜莲，路岩莉，房艳艳，聂坤，刘菁

(1.天津中医药大学，天津 300193;2.天津中医药大学第一附属医院，天津 300193)

血脑屏障由毛细血管内皮细胞、细胞间紧密连接、基膜、周细胞、星型胶质细胞足突及极狭小的细胞外隙共同组成[1]，它是血液与脑组织之间的天然屏障，能维持中枢神经系统内环境的相对稳定。但也由于其屏障作用，使得诸多以脑组织海马区为靶点的抗癫痫药物难以透过血脑屏障发挥作用，导致药效显著降低，癫痫的治疗，尤其是难治性癫痫(Intractable Epilepsy，IE)的治疗遭遇瓶颈。因此寻找增加血脑屏障通透性的药物，提高脑组织中的药物浓度也势在必行。本实验拟从研究熄风胶囊对一线抗癫痫药物卡马西平(Carbamazepine,CBZ)在难治性癫痫大鼠血液和脑细胞外液中的药物浓度的影响入手，来进一步观察熄风胶囊的具体疗效，为其在难治性癫痫领域的更广泛推广提供理论与实验依据。

1 难治性癫痫动物模型的建立

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物

SPF级健康雄性SD大鼠，体质量(45±10)g，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供。

1.1.2 实验药品

氯化锂(批号为115K1308，100 g/瓶，美国Sigma公司)；阿托品(批号为国药准字H12020384，1 mL：5 mg，天津金耀氨基酸有限公司)；盐酸匹罗卡品(批号为066k1730，5 g/瓶，美国Sigma公司)；地西泮注射液(批号为国药准字 0804032，2 mL∶10 mg，天津金耀氨基酸有限公司)；熄风胶囊(制剂许可证号为津 ZX20010010，批号为津药制字(2001)Z 第 0252 号，0.33 g/粒，天津中医药大学第一附属医院杏林药厂)；卡马西平(批号为国药准字 H11022279，200 mg/片，北京诺华制药公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 基本步骤

氯化锂按127 mg/kg的剂量进行腹腔注射，18 h后硫酸阿托品1 mg/kg腹腔注射，30 min后匹罗卡品30 mg/kg(浓度1%，首次20 mg/kg,30 min后10 mg/kg)腹腔注射，大鼠出现癫痫持续状态1 h后，再给与腹腔注射地西泮10 mg/kg解除抽搐，如痫性发作不能缓解，可重复注射地西泮1～2次，直到痫性发作被解除。

1.2.2 模型评价

0级：无反应；1级：耳面部抽搐；2级：肌阵挛，不伴直立位；3级：肌阵挛，伴直立位；4级：全身强直阵挛发作；5级：全身强直阵挛发作，伴失去体位。

痫性发作达到4及以上，解除痫性发作后状态良好的大鼠为合格的模型。

1.2.3 实验动物的分组及处理

1.2.3.1 分组

将造模成功的84只大鼠，随机分为7组，每组12只：卡马西平组、熄风胶囊低剂量组(熄低组)、熄风胶囊中剂量组(熄中组)、熄风胶囊高剂量组(熄高组)、熄风胶囊加卡马西平组(熄卡组)、熄风胶囊加卡马西平1/2剂量组(熄卡低组)、模型组；造模前随机选取12只大鼠，作为正常对照组(空白组)。

1.2.3.2 灌胃

卡马西平组：卡马西平20 mg/kg；熄低组：熄风胶囊0.33 g浓缩剂2 mL；熄中组：熄风胶囊0.66 g浓缩剂2 mL；熄高组：熄风胶囊0.99 g浓缩剂2 mL；熄卡组：熄风胶囊0.66 g浓缩剂2 mL和CBZ 20 mg/kg；熄卡低组：熄风胶囊0.66 g浓缩剂2 mL和CBZ 10 mg/kg；模型组：生理盐水2 mL；空白组：生理盐水2 mL。

每天上午灌胃1次，共持续2个月。

1.2.3.3 监控

采用影像监控系统对所有实验大鼠全程监控并观察各组大鼠反复自发性发作(Spontaneous Recurrent Seizures,SRS)的情况。

1.3 实验结果

氯化锂-匹罗卡品IE动物模型成功大鼠的行为学改变主要分为三期。急性期：腹腔注射匹罗卡品15～30 min后，大鼠出现凝视、湿狗样抖动、阵发性耳面部抽搐、节律性点头、双侧前肢阵挛、出汗、口中流涎，随后出现剧烈狂奔、跳跃、跌倒，并出现伴直立体位甚至摔倒的全身强直性阵挛发作。发作时口吐泡沫、头部后仰、尾部 上翘、四肢强直、全身肌肉剧烈抽搐，最终反复发作达到癫痫持续状态(StatusEpileptieus，SE)。潜伏期：SE后2～14 d，主要表现为精神萎靡、消瘦、进食活动少，SRS较少。慢性期：SE后15～60 d，如前肢阵挛或面部抽搐等局部性发作，很快发展至全身强直性阵挛发作，持续时间一般不超过1 min，SRS均可自行终止。

表1 熄风胶囊对 IE 大鼠 SRS 的影响

注：与空白组比较，◆P<0.05；与模型组比较，■P<0.05；与CBZ组比较，▲P<0.05

如表1所示，空白组未见SRS发作，各实验组均有SRS发作，与模型组比较，各治疗组SRS发作次数均低于模型组(P<0.05)；与卡马西平组比较，熄卡组和熄卡低组的SRS发作次数低于卡马西平组(P<0.05)。

1.4 小结

本实验成功复制了IE动物模型，选择的动物为出生后16天大鼠，药物干预至2月龄，相当于儿童的幼儿期至青春期，用于研究儿童期IE，采用的匹罗卡品剂量是小剂量多次重复注射，能够达到发作级别且点燃率较高，死亡率较经典用量明显下降。并在实地及影像监控系统中观察到了IE模型大鼠的三期行为学表现，与人类IE行为学表现一致，熄风胶囊能减少有效控制IE大鼠SRS次数，且与卡马西平(Carbamazepine，CBZ)联合治疗时的效果优于单纯CBZ治疗。

2 脑微透析液的收集与高效液相色谱法的检测

2.1 材料

2.1.1 仪器

脑立体定位仪(68002，深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；STRONG90+102颅骨钻(SAESHIN PRECISION IND.CO.，韩国)；玻璃子体水门汀(批号：201506，上海医疗器械股份有限公司齿科材料厂)；微透析系统包括：CMA130体外固定支架，CMA402双通道微量注射泵，CMA470低温微量收集器，CMA120清醒活动装置，1.0 mL玻璃微量注射器，均购自瑞典CMA/Microdialysis公司；五通转环清醒活动装置和ABS 型自动采血仪(Instech Laboratories,Inc，美国)；CMA 12微透析探针(膜长为4 mm，分子截留量20 kD)及MAB 14 IC探针导管(Microbiotech/se AB公司，瑞典)；YP2001N电子天平(上海精密科学仪器有限公司)。分析天平(Sartorius CPA2245，德国)，低温离心机(Hettich Rotanta 460R，德国)。一次性使用静脉输液针(天津哈娜好医材有限公司)，掌上离心机(Dragonlab D1008，大龙兴创实验仪器(北京)有限公司)。

2.1.2 药品与试剂

10%水合氯醛(水合氯醛，批号：20130201，国药集团化学试剂有限公司)，生理盐水(氯化钠注射液，批号B14041607，山东康宁药业有限公司)；人工脑脊液Ⅰ(批号：2014080301，湖州英创生物科技有限公司)；肝素钠(国药集团化学试剂有限公司，批号20120612)。卡马西平标准品(SIGMA, cat: 94496)，用于体外回收率测定及给药。色谱纯甲醇(MeOH)购于Fisher公司，批号150940；色谱纯乙腈(ACN)购于Fisher公司，批号148407；甲酸(HCOOH)购于CNW科技有限公司，批号L401K140；水，屈臣氏。以上药品及试剂均在4℃冰箱保存。

2.1.3 动物

从卡马西平组，熄卡组及熄卡低组各选取6只大鼠，IVC笼具(Tecniplast独立通气笼，意大利)，2只/每笼饲养，环境温度为23℃。

2.2 微透析套管的埋置

将灌胃2个月后的IE大鼠用10%的水合氯醛麻醉，根据包新民《大鼠立体定向图谱》，定位在海马区，在定位坐标处，颅钻打孔，插入探针导管并固定，术后禁食，自由饮水。

2.3 探针体外回收率的测定

配置10 μg/mL的卡马西平标准液，探针前端浸在溶液中，人工脑脊液流速2 μL/min，平衡1 h后，连续收集流出液每次30 μL,共3管。高效液相检测出流出液药物浓度。探针的体外回收率=流出液药物浓度/标准液药物浓度。本实验的卡马西平平均体外回收率为26.2%

2.4 微透析活体取样

将微透析探针(膜长为4 mm，分子截留量20 kD)经套管插入大鼠海马区，微灌注泵恒定流速为2 μL/min。平衡1 h后，开始收集样品，时间为给药后15、30、45、60、90、120、150、180 min，每次25 μL。-80℃冰箱保存，2周内进行高效液相检测。

2.5 采集血浆样品

大鼠麻醉后，颈总静脉插管，于同一时间点，收集血液样品，取完后离心，4 000 r/min，4℃离心10 min，取血浆50 μL，转存于-80℃冰箱内。

2.6 血浆和脑透析液卡马西平游离药物浓度的测定

2.6.1 样品的预处理

10 μL大鼠血浆样品+10 μL乙腈/水+280 μL内标(丁螺环酮100 ng/mL，甲醇/乙腈配制)，充分涡旋1 min，4 ℃ 15 000 r/min离心10 min，取上清溶液10 μL，用190 μL乙腈/水稀释涡旋混匀，再取溶液40 μL,用160 μL乙腈/水稀释涡旋混匀，进样分析；10 μL透析液样品+10 μL乙腈/水+280 μL内标(丁螺环酮50 ng/mL，甲醇/乙腈配制)，充分涡旋1 min，4 ℃ 15 000 r/min离心10 min，取上清溶液10 μL，用190 μL乙腈/水稀释涡旋混匀，进样分析。

2.6.2 色谱条件

色谱柱为Agilent Zorbax XDB-C18 column (3.5 μm，2.1 mm×50 mm)，S/N. USHP005327，流动相：A 0.1%FA-水；B乙腈，流速：0.45 mL/min，进样量：10 μL，见图1。

图1 卡马西平的标准色谱图

2.6.3 统计学分析

3 结果

3.1 样品含量测定

根据高效液相色谱的分析方法，分别对各组大鼠血液和脑细胞外液中样品进行分析，测定不同时间点的卡马西平的浓度，并且绘制出平均药时曲线。见图2～4。

图2 大鼠各组脑微透析液中卡马西平样品的色谱图 A.卡马西平组；B.熄卡组；C.熄卡低组

图3 大鼠各组血液中卡马西平样品的色谱图 A.卡马西平组；B.熄卡组；C.熄卡低组

图4 各组大鼠血药浓度曲线图

3.2 各组大鼠血液及脑细胞外液药物浓度比较

与卡马西平组相比，熄卡组中卡马西平的血药浓度在各个时间点略有升高，平均升高0.93%，但无统计学意义；熄卡组中卡马西平的脑药浓度在各时间点同样有所升高，且升高幅度较大，平均升高31%(在30～90 min，P<0.05)。与熄卡组相比，熄卡低组的卡马西平的血药及脑药浓度在各个时间点虽均降低，但高于熄卡组中卡马西平浓度的一半(在15～90 min，P<0.05)。见表2～3。卡马西平浓度的脑血比：卡马西平组为0.055∶1；熄卡组为0.072∶1；熄卡低组为0.073∶1。

4 结论

熄风胶囊可能在促进卡马西平的吸收方面有一定的作用，并且可能对低剂量的卡马西平促吸收作用更强一些。

熄风胶囊可以增加大鼠卡马西平脑细胞外液的药物浓度，并且增加药物浓度的脑血比值，说明其对开放血脑屏障、增加药物的脑靶向性、促进药物向脑组织分布可能有一定的作用。

熄风胶囊可能对低剂量的卡马西平更加敏感，能够适当减少卡马西平乃至其它抗癫痫西药的服药量，降低卡马西平等西药的副作用与不良反应，增加药物的安全性。

5 讨论

5.1 难治性癫痫的耐药机制与熄风胶囊的组方特点

癫痫是一组以大脑神经元过度兴奋同步异常放电所引起的反复发作性的短暂中枢神经系统功能异常为特征的慢性脑部疾病[2]，是我国的常见病，大部分患者通过正规的一线抗癫痫药物的治疗可以缓解症状，但是仍有三分之一的患者即使经过一线抗癫痫药物的治疗，且血药浓度在有效范围内，发作仍不能有效控制，每月发作4次以上，持续两年，称为难治性癫痫(IE)[3]。目前，导致难治性癫痫的治疗不理想的根本原因，在于脑组织中的药物浓度过低，达不到有效药物浓度，而引起脑中浓度过低的原因中，血脑屏障的屏障作用是核心。已有研究表明，血脑屏障的屏障功能与P糖蛋白(PGP)和多药耐药基因1(MRP1)密不可分，PGP由MRP1编码，存在于脑毛细血管内皮细胞膜内，是能量依赖性的外排泵，限制了许多化合物和代谢产物进入脑内，被认为是血脑屏障功能维持的物质基础之一[4]，生理状态下维持了脑内微环境的稳定，也使许多抗癫痫药物包括卡马西平被迫被泵出细胞外，不能完全进入脑内海马旁发挥最大药效。

表2 各组大鼠不同时间点血液卡马西平药物浓度的比较

注：与熄卡组比较，★P<0.05

表3 各组大鼠不同时间点脑细胞外液卡马西平药物浓度的比较

注：与卡马西平组比较，▲P<0.05；与熄卡组比较，★P<0.05

中药复方熄风胶囊组成为：紫河车、石菖蒲、天麻、川芎、全蝎、僵蚕、蜈蚣、白矾、郁金。方中紫河车益肾填精，补脑益智，可提高认知功能，以达治痫之本。天麻平肝潜阳、熄风止痉，辛润不燥，一味兼具熄风豁痰之长，更配以石菖蒲辛香避秽、豁痰开窍，白金丸行气除痰，川芎、郁金行气活血，配以全蝎、蜈蚣，取其性善走窜，可入脏腑、经络以搜风剔痰逐瘀，以达治痫之标。诸药合用，标本兼顾，扶正祛邪以治痫病顽疾。

5.2 熄风胶囊在本实验中的药理作用

前期研究已表明，熄风胶囊可以有效能够降低MRP1的过度表达[5]，从而降低PGP的含量，增加血脑屏障的通透作用；也用临床实验证明了熄风胶囊对于难治性癫痫是有一定的疗效的[6]。前期的研究从药物的机制和药物的最终效果上，间接的证明了其对血脑屏障的通透作用；而本实验旨在从药物的具体浓度来更直观，更有力的反映这一点。从本实验的结果看，熄卡组各时间点在血药浓度方面，均比单用卡马西平组略高，但无统计学意义；在脑药浓度方面，同样比卡马西平组要高，在30～90 min有统计学意义，可见熄风胶囊在促进卡马西平的吸收与加强其在脑组织中分布两方面均有一定效果，血脑比值的比较也同样说明了熄风胶囊增加了卡马西平的脑靶向作用，促进药物更多地向脑组织分布。而在熄卡组与熄卡低组的血液及脑细胞外液浓度比较中，熄卡低组的卡马西平浓度在各时间点都高于熄卡组中卡马西平浓度的一半(在15～90 min有统计学意义)，所以可以得出，熄风胶囊可能对低剂量的卡马西平更加敏感，能够减少卡马西平的剂量，从而相应减轻它所带来的各种不良反应。卡马西平的疗效指数小，安全度低，血药浓度的个体差异大[7]，引起不良反应的形式多，从轻度的皮疹到严重的条件性皮疹，还有超敏综合征、Stevens-Johnson综合征和中毒性表皮坏死松解症，服用卡马西平前两个月重型药疹的发生率在1/1 000～10/1 000，死亡率高达30%以上[8]，所以需要尽可能的降低不良反应发生的风险。从本实验结果来看，从药动学来看，熄风胶囊可以增加血药和脑药浓度，直接反映了其对血脑屏障通透性的促进作用；从药效学来说，熄风胶囊又可以降低卡马西平的药量，降低发生不良反应的风险,为中药复方治疗难治性癫痫提供了更多实验及理论依据。当然，本实验肯定有片面及不成熟的地方，以后将进一步探究熄风胶囊对于抗癫痫药物的具体的药动学参数，比如半衰期，清除率，表观分布容积，平均驻留时间，生物利用度等的研究。

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