UPLC-MS/MS MRM模式同时测定 参白方中人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、人参皂苷 Rb1以及Siderin 4种成分含量

石慧，谢静，宋宏伟，闫广利，韩莹，孟祥才,王喜军

(黑龙江中医药大学,国家中医药管理局中医方证代谢组学研究中心 国家中医药管理局中药血清药物化学 重点研究室 中美中医方证代谢组学技术合作中心，黑龙江 哈尔滨 150040)

参白方是曹洪欣教授在经典名方升陷汤的基础上，根据临床症候特征进行加减化裁而成，由黄芪、人参、白茅根等药材组成，具有益气升陷、活血化痰、滋阴清热、养心安神的作用，主治大气下陷型病毒性心肌炎后遗症[1]。参白方的含量测定方法至今没有明确报道。通过查阅文献，参白方的主要化学成分有皂苷类成分，如黄芪甲苷、人参皂苷、柴胡皂苷、麦冬皂苷等，并且都具有治疗病毒性心肌炎的作用[2-4]。白茅根为 禾 本 科 植 物 白 茅ImperatacylindricaBeauv.var. major(Nees)C. E. Hubb.的干燥根莲，具有凉血止血，清热利尿的功效[5]，在参白方中为君药，与苦参相配利尿强心，调整心律。白茅根的质量控制通常以白茅素和芦竹素为指标性成分[6],然而这两种成分在禾本科竹亚科植物中普遍存在；部分研究以绿原酸作为白茅根质量控制成分[7]，但其专属性较差。研究表明各地白茅根药材均可检测到4 , 7-二甲氧基-5-甲基-香豆素(Siderin),而混淆品却检测不到[8]，因此本实验白茅根的指标成分选用Siderin。本研究以参白方中君药人参和白茅根的主要成分为指标性成分，采用UPLC-MS/MS MRM模式测定参白方中人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、Siderin以及人参皂苷Rb1的含量，为其质量控制提供依据。

1 材料

1.1 仪器

美国Waters AcquityTMUPLC液相色谱仪(四元梯度泵-在线真空脱气机-自动进样器-二极管阵列检测器-柱温箱)；美国Waters TQD 电喷雾三重四级杆质谱仪；MassLynx V4.1工作站；KQ-500DB超声波清洗器。

1.2 试剂与药品

甲醇(色谱级，德国Merck公司)；蒸馏水(中国广州屈臣氏食品饮料有限公司)；甲酸(色谱级，中国天津科密欧化学试剂有限公司)，甲醇(分析级，天津市富宇精细化工有限公司)。

黄芪(产地内蒙、生产批号1405017S)；人参(产地东北、生产批号141026)；白茅根(产地河北、、生产批号140320)；柴胡(产地甘肃、生产批号141104)；升麻(产地吉林、生产批号140516)；苦参(产地黑龙江、生产批号1401027S)；麦冬(产地四川、批号140831)；桔梗(产地河北、生产批号140831)；茯苓(产地甘肃、生产批号140418)；赤芍(产地内蒙、生产批号140510)；甘草(产地内蒙、生产批号141030)。依据2010版《中国药典》对处方各药材进行鉴定与检验均为正品。

人参皂苷Rg1(110703-201529)，人参皂苷Rb1(110704-201424)，均购于中国食品药品检定研究院；人参皂苷Re(201005)，购于四川省维克奇生物科技有限公司； Siderin(自制)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

Waters ACQUITY UPLCTM HSS T3(2.1 mm×100 mm,1.8 μm)；流动相：A为0.1%甲酸甲醇，B为0.1%甲酸水；梯度洗脱程序：0～1 min，55%～75% A；1～3 min，75%～100% A；3～5 min，100%～100% A；5～5.1 min，100%～55% A；5.1～8 min，55%～55% A。柱温：40℃；样品仓温度预设：4℃；流速：0.4 mL/min；进样体积：2 μL。

2.2 质谱条件

采用正离子检测模式，电喷雾电离源，毛细管电压：3.00 kv；锥孔采样电压：30 v；锥孔提取电压：3.0 v；去溶剂气温度：350℃；去溶剂气流量：600 L/hr；碰撞气流量：50 L/hr；离子源温度：110℃；扫描模式：MRM模式，各化合物质谱信息见表1，UPLC MS/MS 图谱见图1。

表1 参白方指标成分含量测定质谱采集离子信息

图1 人参皂苷等供试品溶液UPLC-MS/MS MRM色谱图1:人参皂苷Re；2：人参皂苷Rg1；3：Siderin; 4:人参皂苷Rb1

2.3 溶液配制

2.3.1 供试品溶液的制备

按处方比例取药材，先加9倍量70%乙醇浸泡1 h，回流提取1 h，滤过，药渣再加8倍量70%乙醇提取1 h，合并滤液，浓缩，减压干燥，得处方提取物。精密称取提取物1 000 mg于具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称重，超声60 min，称定重量，补足失重，过0.22 μm微孔滤膜于进样杯中，供UPLC检测。

2.3.2 阴性样品制备

分别按“2.3.1供试品溶液的制备”项下方法制备缺少人参，白茅根的阴性样品溶液。

2.3.3 对照品溶液的制备

分别精密取人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、Siderin以及人参皂苷Rb1对照品适量，加甲醇分别配制成对照品溶液；分别精密取人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、Siderin以及人参皂苷Rb1对照品溶液130 μL，320 μL，220 μL，320 μL于25 mL容量瓶中，得到浓度分别5.267 6，10.982 4，0.877 4，17.152 μg/mL的混标储备液。

2.4 专属性

按照处方比例及工艺，分别制备缺少单味药材人参、白茅根的阴性样品，并按 “供试品溶液的制备”项下方法制备阴性样品溶液。取对照品溶液、供试品溶液和各阴性样品溶液，按照色谱和质谱条件方法进样分析，专属性良好。

2.5 线性关系考察

取2.3.3项下混标储备液1，3，5，7，7.5 mL分别于10 mL容量瓶中，甲醇定容，得标准曲线对照品溶液。分别进样测定，以各物质特征碎片离子峰面积(y)对被测组分的质量浓度(x，μg/mL)进行线性回归，得到回归方程、相关系数和线性范围。结果见表2。

表2 参白方指标成分标准曲线

2.6 精密度考察

按2.3.1供试品溶液制备方法制备溶液，连续进样6次，记录色谱峰的峰面积。测得人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、Siderin以及人参皂苷Rb1的峰面积RSD值分别为1.28%、1.30%、2.73%、1.21%，表明该方法精密度良好。

2.7 重复性考察

按2.3.1供试品溶液制备方法制备溶液，平行制备6份，检测，记录色谱峰的峰面积，计算各指标成分的平均含量。测得人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、Siderin以及人参皂苷Rb1的平均含量分别为32.39、63.94、6.52、75.09 μg/g，RSD值分别为0.68%、0.68%、2.90%、1.49%，表明该方法重复性良好。

2.8 稳定性考察

按2.3.1供试品溶液制备方法制备溶液，分别于0，2，4，6，8，10，12 h进样测定，记录峰面积，测得人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、Siderin以及人参皂苷Rb1的峰面积RSD分别为2.67%、2.63%、3.90%、2.16%，表明供试样品在12 h内稳定。

2.9 回收率考察

取已知含量处方提取物，精密称定，加入对照品溶液适量，按2.3.1供试品溶液制备方法制备溶液，平行制备6份，检测，各成分的回收率分别在99.86%～100.97%， RSD 0.91%～2.74%。结果见表3。

表3 参白方指标成分回收率试验结果

表4 参白方指标成分含量测定结果(μg/g)

2.10 样品测定

按照2.3.1项下的参白方提取物制备方法制备3批样品，然后按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液，进样检测，对各指标成分进行含量测定，结果见表4。

3 讨论

参白方的含量测定方法目前尚未有研究，实验前期曾尝试采用高效液相色谱法对参白方中的有效成分进行含量测定，发现存在各成分相互干扰，分离度差，样品溶液制备方法繁琐等问题，因此采用UPLC-MS/MS法建立参白方含量测定方法。UPLC-MS/MS 法具有高选择性、高灵敏度，分析速度更快等特点，利用三重四级杆质谱的MRM(多通道离子检测)模式，可以排除背景干扰，并且不要求被测成分完全分离，因此选用UPLC-MS/MS对参白方有效成分进行含量测定。本方法可在短时间内快速分离检测参白方中人参皂苷Re、人参皂苷Rg1、Siderin以及人参皂苷Rb1 4 种主要成分，该方法经过考察，准确，快捷，重复性好，符合中药制剂的相关分析要求，可用于参白方的质量控制。

[1] 曹洪欣.参白汤治疗病毒性心肌炎后遗症的临床观察[J].中医药学报,1993,21(4):27-28.

[2] 古平,何民.黄芪总苷治疗小鼠柯萨奇B3病毒性心肌炎的实验研究[J].西南国防医药,2007,17(3):281-284.

[3] 程志清,徐田红,高瑞兰,等.人参皂甙对急性病毒性心肌炎小鼠穿孔素表达的干预作用研究[J].中医药学刊,2003,21(3):350-353.

[4] Miaomiao Jiang,Liyuan Kang,Yi Wang, et al.A metabonomic study of cardioprotection of ginsenosides, schizandrin, and ophiopogonin D against acute myocardial infarction in rats[J].BMC Complement Altern Med,2014,14:350.

[5] 中华人民共和国药典(一部)[M]．北京:中国医药科技出版社,2010:99.

[6] 路金才,孙启时,王明雷,等.白茅根中芦竹素和白茅素的含量测定[J].沈阳药科大学学报,1996,13(4):290-291.

[7] 王海侠,姚青春,时维静,等.白茅根中绿原酸的提取与含量测定[J].中国中医药科技,2010,17(4):331-332.

[8] 赵燕燕,曹悦,孙启时.RP-HPLC法测定白茅根中siderin含量[J].沈阳药科大学学报,2007,24(2):86-88.