青藤碱对异丙肾上腺素诱导小鼠心肌肥厚的影响*

李依琪， 李 乐

(1. 浙江工业大学药学院药剂13级， 2. 浙江工业大学药学院， 杭州 310014)

心肌肥厚(cardiac hyoertrophy,CH)是心肌细胞对压力或容量负荷的适应性表现，显示为心肌细胞肥大、间质纤维化和电生理特性改变。被确认是心衰、冠心病、猝死等的单独高危因素，而其形成机制复杂，无特效治疗药物[1]。因此，有效防治CH的药物研究有重要临床价值。青藤碱(sinomenine，Sin)是来自中药青风藤的生物碱，临床治疗风湿及抗心律失常。而且，药理学研究显示，Sin能改变心肌电生理特性，有抗炎作用，通过清除氧自由基与抗脂质过氧化而对抗氧化应激，氧化应激和炎症反应与CH发生发展密切相关[2]。目前，国内外尚无Sin对CH作用的研究。本实验利用异丙肾上腺素(isoprenaline,Iso)诱导小鼠建立CH模型，观察Sin拮抗CH的作用及其机制，为其临床应用提供动物实验资料。

1 材料与方法

1.1 实验动物、药品与试剂

昆明种小鼠，雌雄各半，体重(20±2)g，购自浙江省实验动物中心，批号：SCXK(浙)2015-0024。Sin，西安小草植物科技公司(XC20141120,纯度≥98%)；盐酸Iso注射液(上海禾木制药有限公司，140906)；乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、丙二醛(malondialdehyde, MDA)及总超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)、蛋白定量试剂盒(南京建成研究所)。兔抗NF-κB抗体(美国Santa Cruz)，辣根过氧化酶山羊抗小鼠抗体IgG(美国cell signaling)。

1.2 主要仪器

RJ-酶标仪(美国BD 公司)；722N分光光度计(上海精密科学仪器公司)；KDC-2046低温离心机(中科大创新股份有限公司)；Qwin图像分析软件(德国Leica)。

1.3 动物分组、造模、 给药

健康昆明种小鼠48只，雌雄各半，随机均分为对照组、Iso模型组、Iso+Sin 50 mg/kg组、Iso+Sin 200 mg/kg组。除对照外，其余组小鼠均i.hIso，逐日一次，当日剂量40 mg/kg，第2日20 mg/kg，第3日10 mg/kg，之后保持10 mg/kg，持续14 d。随意进食、饮水，创建CH模型，对照组每天i.h等量生理盐水。 给药和造模同时进行，每日上午注射Iso 4 h后，分别给予Sin 50 mg/kg和200 mg/kg灌胃治疗，逐日一次;对照组和模型组等量生理盐水灌胃，持续4周。

1.4 心脏重量指数测定

小鼠末次用药12 h后，称体重(body weight, BW)，眼球取血处死取心脏，冷生理盐水冲洗，滤纸吸干称全心重(heart weight, HW)；分离左心室，称左心室重量(left ventrical weight，LVW)，分别计算心重指数(HWI=HW/BW)和左心室重量指数(LVWI=LVW/BW)。另取心肌左室标本， HE及Masson染色，光学显微镜下观察病理变化。

1.5 心肌组织SOD、MDA水平及血清LDH测定

小鼠眼球取血后于4℃，3 000 r/min，离心10 min，分离血清，按LDH试剂盒说明测定LDH活性；取小鼠心肌组织，制备匀浆，于4℃，2 000 r/min，离心10 min取上清液分别按试剂盒说明测定SOD和MDA水平。

1.6 心肌组织学观察

左室心肌组织，4%甲醛过夜，酒精脱水石蜡包裹， HE及 Masson 染色，光学显微镜摄像(400倍)，Image-Pro Plus 5.0软件随机测定Masson染色切片视野中蓝染部分，分析心肌纤维化面积。

1.7 免疫组化测定小鼠心肌NF-κB蛋白表达水平

石蜡切片脱蜡水化，3%双氧水浸润20 min，羊血清孵化10 min，顺次加NF-κB一抗,室温60 min，山羊抗小鼠IgG二抗室温30 min，链亲和素-过氧化酶溶液室温10 min，DAB显色，苏木素复染，脱水封片，显微镜观察。Qwin图像分析软件对组织切片染色胞浆中阳性表达(棕黄色颗粒)进行定量，测算镜下光密度值。

1.8 统计学处理

2 结果

2.1 小鼠心脏质量参数

与对照组比较，i.hIso后 ，Iso模型组小鼠HWI和LVWI增大,符合《药理实验方法学》中CH模型标准，显示CH构建成功。Iso+Sin 50 mg/kg,200 mg/kg治疗组，HWI和LVWI比Iso模型组有所减小，差异有统计学意义, 200 mg/kg Sin的作用更明显(表1)。

GroupDose(mg/kg)HWI (mg/g)LVWI (mg/g)Control-3.21±0.142.27±0.17Iso model-3.89±0.34∗∗2.95±0.23∗∗Iso+Sin503.75±0.28#2.68±0.32#Iso+Sin2003.56±0.32##▲2.47±0.24##▲

HWI： Heart weight index； LVWI： Left ventricular weight index

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsIso model group;▲P<0.05vsIso+Sin 50 mg/kg group

2.2 小鼠血清LDH活性和CH组织中氧化损伤指标

连续i.h Iso后，Iso模型组小鼠血清LDH活性、心肌组织MDA含量提高，T-SOD活性降低，与对照组比较差异有显著性(P<0.01)；用Sin 50、200 mg/kg治疗后，各治疗组LDH、MDA较Iso模型组下降，T-SOD上升，差异有统计学意义, 200 mg/kg Sin的作用更明显(表2)。

GroupDose(mg/kg)LDH(U/L)MDA (mmol/mg.prot)T-SOD(U/mg.prot)Control-396±4847±8184±76Iso model-729±82∗∗86±12∗∗51±18∗∗Iso+Sin50563±67#63±11#83±25#Iso+Sin200431±56##$52±9##▲138±74##▲

LDH: Dehydrogenase; MDA: Malondialdehyde; T-SOD: Total-superoxide dismutase

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsIso model group;▲P<0.05vsIso+Sin 50 mg/kg group

2.3 心肌组织病理学

光镜下，对照组心肌细胞排列归整、胞质着色均匀。Iso模型组心肌细胞体积增大，胞核体积变大深染，细胞间蓝染纤维化增多和炎性细胞浸润。高剂量Sin治疗后，心肌细胞排列较齐整，细胞肥大减缓，炎性细胞浸润及间质纤维化减少(图1)。

Fig.1Pathological changes of myocardial tissue in each group of mice(The upper figure HE staining, the lower figure Masson staining, ×100)

A: Control group; B: Isoprenaline(Iso)model group; C: Iso+sinomenine(Sin)50 mg/kg group; D: Iso+sin 200 mg/kg group

2.4 小鼠心肌组织NF-κB蛋白表达水平

图2,图3显示，与对照组比较，模型组心肌NF-κB蛋白表达明显上调，差别有显著性意义(P<0.05)。Sin治疗后， NF-κB蛋白表达下调，与模型组比较，差别有统计学意义(P<0.05)。

Fig.2Changes in the expression of NF-κB protein in the myocardium of mice(×100)

A: Control group; B: Isoprenaline(Iso)model group; C: Iso+sinomenine(Sin)50 mg/kg group; D: Iso+sin 200 mg/kg group

Fig.3Changes in the expression of NF-κB protein in the myocardium of mice

A: Control group; B: Isoprenaline(Iso)model group; C: Iso+sinomenine(Sin)50 mg/kg group; D: Iso+sin 200 mg/kg group

**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsIso model

3 讨论

CH是很多心血管疾病共同的病理表现，其心肌中有严重炎症反应，恶化心肌损伤，诱发心室重构，最终导致心力衰竭[3]。利用i.hIso致CH是常用的动物造模方法，本实验i.hIso后4 周，HWI、LVWI、LW/BW显著性增大，结合HE染色心肌细胞肥大，Masson 染色间质纤维化显著,提示Iso造CH模型成功。

氧化应激是指活性氧( reactive oxygen species，ROS) 产生过多后导致组织细胞损伤。ROS是诱导体内发生氧化应激的主要物质，包括超氧阴离子、过氧化氢和羟基自由基等。ROS与多不饱和脂肪酸反应的产物是脂质过氧化物，因此MDA 的含量可以反映机体氧化应激损伤的程度。SOD即超氧化物岐化酶，是人体对抗内、外环境超氧离子损害的重要酶。MDA水平提高，SOD活性下降，即可诱导氧化应激，引发细胞损害甚至细胞死亡[4]。实验结果显示，Sin组能减弱Iso诱导的小鼠CH程度， 降低 HWI、LVWI比值。HE和 Masson 染色证明心肌细胞肥大程度减轻，间质纤维化减少；提示Sin抑制心肌细胞肥大和纤维化；同时，Iso诱发的CH模型组小鼠，血清LDH水平、心肌MDA含量升高及心肌T-SOD活性降低；应用Sin治疗，可明显降低血清LDH水平、心肌MDA含量、提高心肌T-SOD活性，表明Sin 能对抗氧化应激，对心肌有保护作用。

CH时心肌局部有不少炎症介质被激活，如 NF-κB、TNF-α、IL-1β 等，核因子 NF-κB可刺激TNF-α和IL-1β等细胞因子的表达，同时，NF-κB/IκB信号通路激活，促进心脏形成CH[5]。Sin通过抑制 NF-κB蛋白表达，减弱心肌中炎症反应及NF-κB/IκB信号通路活化，对抗CH。

综上所述，Sin可能通过对抗 NF-κB蛋白表达、对抗氧化应激及脂质过氧化而起心肌保护作用，这为Sin将来临床应用防治CH提供新思路。