促卵泡刺激素对小鼠卵巢玻璃化冻存的抗凋亡作用*

陈 杰， 王燕蓉， 常 青， 于泊洋

(1. 内蒙古医科大学人体解剖学教研室， 呼和浩特 010000； 2. 宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室、 宁夏生殖与遗传重点实验室， 银川 750004； 3. 内蒙古医科大学生理学教研室， 呼和浩特 010000)

随着医疗水平的飞速发展，癌症治愈率大大提高，患者长期存活已成为现实，但年轻化趋势明显的特殊情况，使大量青年及未成年女性癌症患者在接受放化疗治疗过程中遭受着损伤性腺、影响生育力的双重风险。为此，如何在经历抗癌治疗过程中有效保护卵巢组织，保存癌症患者的生育力，提高生活质量成为目前国内外在本领域的研究重点。卵巢组织冻存是抗癌治疗过程中保护女性生育力的首选方法，但冻存过程中的卵泡丢失及损伤是该技术面临的巨大挑战。玻璃化冻存技术的不断发展与进步，使卵巢组织得到快速有效的冷冻，避免冰晶形成对卵泡的损伤，无疑是卵巢组织冻存的有效途径。FSH是卵泡存活因子，与卵泡生长发育以及人类生殖有着密切联系[1]，而卵泡又是卵巢的结构和功能基础，结合本课题组前期研究，小鼠卵巢玻璃化冻存过程中添加FSH(follicle-stimulating hormone，FSH)，不仅可以提高卵泡存活率，还可有效缩短冻融卵巢组织再移植后血流重建时间[2]。报道称，外源性凋亡途径是引发小鼠卵巢颗粒细胞凋亡的主要原因[3]，为此，卵巢组织冻存过程中的损伤以及移植后血管的再生是触发卵泡凋亡的关键步骤，而凋亡是卵泡闭锁的重要原因，冻融卵巢再移植后丢失的卵泡高达60%[4]。active caspase-3作为凋亡执行蛋白，可有效启动凋亡程序，造成卵巢卵泡大量凋亡。FSH具备通过抵抗凋亡启动因子caspase-3发挥其抗凋亡作用[5]，而凋亡执行蛋白caspase-3只有在被激活为active caspase-3时，才能够启动凋亡程序，导致卵泡凋亡。因此，研究FSH对凋亡执行蛋白active caspase-3表达的影响，将为FSH在小鼠卵巢玻璃化冻存过程中提高冻存效率提供有力的实验室研究证据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

以4周龄清洁级C56BL/6J雌性小鼠为研究对象，购自美国杰克逊实验室，光照周期为12 h照明/12 h黑暗，室温保持在22～24℃，自由取食饮水。

1.2 主要试剂

促卵泡刺激素(follicle-stimulating hormone，FSH)：注射用重组人促卵泡刺激素(果纳芬)购自默克雪兰诺公司，人血清白蛋白购自Sigma公司(纯度≥96%)，一抗active caspase-3为兔抗小鼠多克隆抗体购自英国Abcam公司。

1.3 液体的配置

基液：DMEM与F12等比例配置。培养液：含12%人血清白蛋白(HSA)，FSH浓度为0.3 IU/ml。预平衡液：含1.5 mol/L乙二醇。玻璃化液为我室自主研制的EG5.5-30玻璃化液。解冻液：分别为含0.5 mol/L、0.25 mol/L以及0.125 mol/L的蔗糖液。

1.4 卵巢的获取

首先通过阴道图片观察小鼠动情周期，取动情间期小鼠，颈椎脱臼处死后于75%酒精浸泡消毒，在肋脊角处切开皮肤及肌肉，暴露卵巢，剥去卵巢外膜后完整切除双侧卵巢，为下一步冻存前培养做准备。

1.5 实验分组

根据研究目的共分为3组，每组20枚卵巢，10枚进行HE染色后的正常卵泡百分比计数，另外10枚进行免疫组织化学法观察。(1)新鲜对照组(control group,CG)：提取卵巢组织后，不施加任何干预直接固定或直接提取蛋白。(2)玻璃化冻存对照组(vitrification control group,VCG)：无FSH。(3)0.3 IU/ml FSH干预玻璃化冻存组，全程添加FSH组(overall process of vitrification group-FSH，OG-FSH)。

1.6 玻璃化冻存及解冻程序

小鼠卵巢入培养液在37℃CO2培养箱培养60 min，接着入1.5 mol/L乙二醇中预渗透平衡8 min，再移入EG5.5-30玻璃化液渗透平衡3.5 min，之后投入-196℃的液氮罐中保存，全过程在22～24℃下进行。冻存1 d将卵巢从液氮中取出，置于在37℃水浴内预热的解冻液中洗脱玻璃化液，于各浓度解冻液中渗透平衡10 min，最后入培养液在37℃CO2培养箱培养120 min，以充分洗涤保护剂。

1.7 组织切片的制作及卵泡计数

保护剂洗脱后，将30枚卵巢以4%多聚甲醛固定24 h，常规方法制作石蜡切片(5 μm)，进行HE染色及免疫组织化学观察。

HE观察指标：每组任选取3张切片，在高倍镜下每张切片任选5个视野根据卵泡形态的正常与否进行每高倍视野(high power field,HPF)的卵泡计数。正常的卵泡为包含一个完整的卵母细胞和排列整齐的颗粒细胞层，卵母细胞或颗粒细胞未见浓缩核；相反，若卵母细胞核固缩、卵母细胞萎缩、颗粒层排列紊乱等出现一项就表明卵泡退化，视为形态结构异常卵泡。计数正常卵泡数及卵泡总数，再通过百分比计算公式计算出正常卵泡百分比，最后进行统计学分析。

1.8 active caspase-3免疫组织化学观察

石蜡切片常规脱蜡至脱水,PBS工作液冲洗(5 min×3次)。抗原修复：将切片放入已沸腾过的枸橼酸盐缓冲液中微波加热13 min后充分放凉，PBS冲洗(5 min×3次)。3% H2O2室温孵育10 min，避光，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS冲洗(5 min×3次)。山羊血清工作液封闭25 min。滴加一抗active caspase-3，稀释比例为1∶1 000，孵育，4℃过夜。室温条件下孵育60 min，PBS冲洗(5 min×3次)。加入二抗，37℃孵育60 min，PBS冲洗(5 min×3次)。室温条件下DAB显色，镜下控制反应速度，适时水终止反应。复染。封片：梯度酒精上行脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察切片。

阳性细胞判断标准：棕黄色即为阳性反应。采用DP Ctroller 3.1.1.267图像采集系统明场拍照，将影响光强的因素改为手动调节且固定，每张照片均采取白平衡措施，于低倍镜下选择蛋白阳性表达的“热区”， 然后在此区内选取5个不同的高倍视野拍照。采用Image Pro Plus 6.0图像全自动分析系统，计算染色部位着色深浅，用累积光密度(IOD)表示，然后取其均值，可以全面反应蛋白表达量，为下一步统计学分析做准备。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 冻存全程添加FSH干预后卵巢组织形态学观察

HE染色结果表明，冻存全程没有添加FSH干预的玻璃化冻存对照组(VCG) ，卵泡形态结构破坏严重，卵母细胞皱缩情况发生频繁，各组在卵泡总数上差异不明显(F=1.114，P=0.432)，而正常卵泡百分比各组间比较差异具有统计学意义(F=37.57，P<0.01)，表现为OG-FSH组最高(P< 0.05，图1，表1)。

Fig.1Morphologic observation of vitrification ovary(HE stain)

★： Primordial follicle； ▲： Primary follicle； ●： Secondary follicle; A: Control group (CG); B: Vitrification control group(VCG); C: Vitrification group intervention by 0.3 IU/ml FSH(OG-FSH)

Tab. 1 Number of follicle after vitrification/HPF

CG: Control group; VCG: Vitrification control group; OG-FSH: Overall process of vitrification group-follicle-stimulating hormone

*P<0.05vsCG;#P<0.05vsVCG

2.2 FSH干预对玻璃化冻存卵巢组织active caspase-3蛋白表达的影响

观察免疫组织化学技术结果显示，玻璃化冻存全程未添加FSH干预性保护的玻璃化冻存对照组(VCG)，凋亡执行蛋白active caspase-3蛋白表达量最高，差异显著(P<0.05，图2，表2)。

3 讨论

卵巢组织深低温冻存技术已成为保护女性癌症患者生育力的有效方法，但冷冻对卵泡的损伤需要我们探讨激素的保护效率。FSH作为卵泡存活因子，不仅在卵泡的发育及成熟过程中起到关键作用，同时还可在幼稚卵泡周围颗粒细胞发育过程中间接抑制凋亡执行蛋白的激活，从而起到抵抗凋亡促进生殖功能作用[6，7]。Active caspase-3是凋亡启动家族的重要成员，是caspase-3的活化形式，而每种凋亡执行蛋白只有在转化为活化形式后才能发挥作用，为此我们可以通过研究active caspase-3的表达情况来了解细胞凋亡。active caspase-3为构成卵泡的卵母细胞和颗粒细胞的重要凋亡标记物[8]，直接参与凋亡的启动及执行过程，与卵泡的凋亡密切相关。

Fig.2The immunohis tochemistry result of active caspase-3 in each group after intervention

*： Primordial follicle； ▲： Secondary follicle；

A: CG(Control group); B: VCG(Vitrification control group); C: OG-FSH(Overall process of vitrification group-follicle-stimulating hormone)

Group Protein expression of active caspase-3CG0.32±0.05VCG0.67±0.06∗OG-FSH0.17±0.14#

*P<0.05vsCG;#P<0.05vsVCG

通过对实验结果的观察，active caspase-3蛋白的表达趋势由高到低依次为玻璃化冻存对照组、新鲜对照组及全程添加FSH组。由此可见，在小鼠卵巢玻璃化冻存全程添加FSH的干预性保护措施有利于卵巢卵泡发育，可有效抵抗卵泡凋亡的发生。同时，冻融卵巢组织的形态学观察表明，虽然卵泡的总体数量在各组间的比较差异不显著，但是冻存全程添加FSH组的正常卵泡百分比于显著高于新鲜对照组及玻璃化冻存对照组。FSH的保护作用，在卵巢组织玻璃化冻存过程中充分体现，对卵泡正常形态结构的维持具有重要作用[9]。根据上述实验结果可以推断，在FSH的积极保护作用下，有效促进颗粒细胞的增殖，减少凋亡的发生[10]，保护卵泡的正常形态结构，减少卵母细胞皱缩，颗粒细胞凋亡的出现，同时也印证FSH在卵巢卵泡生长发育过程中的重要性，可为健康卵泡生长发育提供充足的营养供给[11]。此外，关于FSH促进血管发生的相关报道表明，在卵巢周期性变化过程中，FSH可有效调节卵巢周期中新生血管的形成，从而促进卵泡的生长发育[12]，从另一个角度印证上述实验结果的真实性。

综上所述，玻璃化冻存全程添加FSH的干预模式，可有效保护卵巢组织，对卵泡的发育起到积极作用，有助于卵巢卵泡的正常生长，间接或直接抑制凋亡执行蛋白的表达，起到重要的抗凋亡作用。因此，小鼠卵巢玻璃化冻存全程添加FSH干预模式可有效抵抗凋亡执行蛋白active-caspase-3的表达，有利于卵巢组织形态结构的保护，但FSH在玻璃化冻存过程中究竟是通过怎样的通路发挥作用的，需要我们更深入的研究。