红芪、黄芪及配伍当归对环磷酰胺所致血虚模型小鼠的干预作用*

杨秀娟， 杨志军， 李 硕△， 吉秀家， 宁艳梅， 王 燕

(1. 甘肃中医药大学药学院， 2. 甘肃省高校中(藏)药化学与质量研究省级重点实验室， 兰州 730000)

环磷酰胺(cyclophosphamide, CTX)是典型的抗肿瘤药，同时具有显著的骨髓抑制作用，可损伤骨髓的造血干细胞，使外周红细胞数量降低[1]，引起贫血。贫血属于中医血虚范畴，血虚证是指血液不足或血的濡养功能减退的病理状态[2]。中医认为，有形之血生于无形之气，气为血之帅，血为气之母，气能生血，故在治疗血虚病证，使用补血药时，同时还应与补气药相配。黄芪与当归是中医学应用于血虚病证中常见的配伍组合，以常用的黄芪-当归5∶1的当归补血汤为多见，具有促进造血、增强免疫等功能。

红芪是豆科植物多序岩黄芪(HedysarumpolybotrysHand. Mazz.)的干燥根，药性微温、味甘，归肺、脾经，具有补气升阳，生津养血，行滞通痹等功效[3]。其最早记载于《神农本草经》黄芪项下，并列为上品。在历代本草文献中，黄芪项下的“赤水耆”“赤色者”即为西北地区应用历史悠久的红芪，认为红芪是黄芪的优良品种[4]。自1985 年版《中国药典》开始，将红芪单列为一种中药，现主要分布在甘肃陇南、天水、定西等地区，为甘肃十大陇药之一，具有悠久的生产历史[5]。黄芪-当归以5∶1配伍，其中当归可养血，黄芪可补气生血，二者在补血作用中配伍相得益彰。红芪与黄芪具有相似的功效，红芪与当归配伍是否具有一定补血作用并未见相关报道，本课题将对红芪单味药、黄芪单味药、红芪-当归、黄芪-当归配伍进行血瘀模型小鼠补血作用的研究，以期为红芪在临床上的应用及开发利用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

昆明种小鼠，SPF级，6～8周龄，体重18～22 g，雌雄各半，共70只，由中国农业科学院兰州兽医研究所提供，动物许可证号：SCXK(甘)2010-0001，动物实验合格证号：0000981。

1.2 药品与试剂

红芪、黄芪、当归药材分别购自武都、陇西和岷县，经甘肃中医药大学药学院杨扶德教授鉴定红芪为豆科植物多序岩黄芪(HedysarumpolybotrysHand. Mazz.)的干燥根；黄芪为豆科植物蒙古黄芪(Astragalusmembranaceus(Fisch )Bge.var.mongholicus(Bge)Hsiao)的干燥根；当归为伞科形多年生草本植物当归Angelicasinensis(Oliv.)Diele的干燥根。驴胶补血颗粒(批号：201607011H，国药准字：Z43021017)；驴胶补血颗粒根据成人临床剂量40 g/(kg·d)按体表系数换算为等效剂量即驴胶补血颗粒给药剂量为5.2 mg/(kg·d)，使用前用纯净水配置；环磷酰胺(批号：16092125，江苏恒瑞)；煌焦油蓝染液(批号：20170315， 北京索莱宝科技有限公司)；PBS缓冲液(批号：20160325，北京索莱宝科技有限公司)；瑞氏染液(批号：G1040，规格：500 ml)；生理盐水(批号：1612193201，石家庄四药有限公司)。

1.3 仪器

MH-1000调温型电热套(京科伟永兴仪器有限公司)；HX-7型电子天平(慈溪市天东衡器厂)；AL104型电子分析天平(METTLER TOLEDO，瑞士)；EV311型旋转蒸发仪(北京莱佰泰科技有限公司)；BC-5390型动物血细胞分析仪(迈瑞生物医疗电子股份有限公司)；微量采血管40 μl(批号20130716，淄博来绪医用器材有限公司)； BX51-H01型倒置显微镜成像系统(奥林巴斯)。

1.4 红芪及不同配伍样品的制备

称取适量红芪、黄芪原药材经切制后，分别称取80 g置水中浸泡1 h，加10倍量水煎煮1 h，滤取滤液；将剩余药渣加入8倍量水煎煮0.5 h，过滤合并滤液，浓缩至200 ml红芪、黄芪水煎液(含药量0.40 g·ml-1)，红芪-当归，黄芪-当归各96 g操作同上(含药量0.48 g·ml-1)，置4℃冰箱保存备用。

1.5 血虚小鼠模型建立[6]

小鼠常规饲喂7 d适应环境后，随机分为7组，每组10只，称取体重并记录。除空白对照组外，其余各组在第1日、3日腹腔注射环磷酰胺80.0 mg·kg-1造模。以外周血象中红细胞(red blood cell, RBC)、淋巴细胞(lymphocyte, LYM)、白细胞(white blood cell, WBC)、红细胞压积(hematocrit, HCT)的量下降为评判依据。

1.6 分组、给药及样品取材

将70只小鼠随机分为空白组、模型组、阳性对照组、红芪组、黄芪组、红芪-当归(5∶1)组和黄芪-当归(5∶1)组。实验开始每天给予空白对照组和模型组灌胃等体积生理盐水，阳性对照组灌胃驴胶补血颗粒药液5.2 mg·kg-1，红芪及黄芪水煎液组灌胃3.9 g·kg-1，红芪-当归组(5∶1)和黄芪-当归组(5∶1)灌胃4.68 g·kg-1，每天1次，连续7 d，给药期间，记录小鼠体重及体征变化。

末次给药24 h后眼眶取血加入已添加EDTA的采血管内，全血采用全自动血细胞分析仪检测外周血象中红细胞(RBC)、淋巴细胞(LYM)、白细胞(WBC)、红细胞压积(HCT)等。眼眶取血用于网织红细胞计数，并观察红细胞的形态，取脾脏、胸腺，分别称重计算脾脏指数(spleen index, SI)，胸腺指数(thymus index, TI)；收集股骨，用于骨髓有核细胞计数，并将股骨浸泡至4%的甲醛中。

1.7 证候学观察

实验开始后，每天称量小鼠体重，并以小鼠耳缘、鼻唇颜色，皮毛状态，以及饮食，运动情况等作为证候学观察指标。

1.8 外周血象指标及网织红细胞的检测[7-8]

取全血采用全自动血细胞分析仪计数外周血白细胞(WBC)、红细胞(RBC)、红细胞压积(HCT)和血小板(platelet, PLT)数量的变化。

小鼠眼眶采血20 μl于已添加等量煌焦油蓝染液的离心管内，充分混匀，静置15 min，取一滴推抹4 cm长薄血膜片，待自然干燥后，用油镜观察血片中央区计数1000个红细胞中的网织红细胞(reticulocyte, RC)数值，以百分数表示，并观察其形态。

1.9 骨髓有核细胞计数[9]

末次给药24 h后，眼眶内眦静脉采集血液，随后各组小鼠脱颈椎处死，分离出两侧股骨。取右侧股骨，擦拭干净，用2 ml生理盐水冲出骨髓细胞，过滤制成单个骨髓细胞悬液。1 500 r/min离心5 min后，弃去上清液，再用3 ml生理盐水稀释，混匀。然后通过血细胞计数板在显微镜下计数骨髓有核细胞数(marrow karyocyte, MK)。

1.10 骨髓切片制备与处理

将左侧股骨浸入4%中性甲醛内固定2 h，再用2%的硝酸脱钙2 h，水洗2次，室温下乙醇梯度脱水各2次，然后用甲液、乙液顺序浸透各12 h，用包埋液封闭，放入-20℃冰箱内过夜，第2日进行切片，苏木素-姬姆萨-伊红染色，最后置于光学显微镜下观察骨髓增生程度及造血细胞变化。

1.11 胸腺指数和脾脏指数

小鼠取血后处死，取胸腺、脾脏称重，以 mg/g单位计算胸腺指数和脾脏指数。脾脏指数(SI)=脾脏质量(mg)/体重(g)；胸腺指数(TI)=胸腺质量(mg)/体重(g)。

1.12 统计学处理

2 结果

2.1 各组小鼠外周血象指标的变化

与空白组比较，模型组中WBC、LYM、PLT、HCT、RBC的含量都显著降低(P<0.01)，表明血虚模型复制成功；与模型组比较，阳性对照组、红芪-当归组、黄芪-当归组中WBC、LYM、PLT、HCT、RBC含量显著升高(P<0.01，P<0.05)，红芪与黄芪组中WBC、LYM的含量升高(P<0.05)，结果表明阳性对照组、红芪-当归组、黄芪-当归组对血虚小鼠外周血象的改善作用优于红芪、黄芪单味药组，阳性对照组与黄芪-当归组效果更佳(表1)。

Tab. 1 Effects of drugs on peripheral hemogram in mice n=10)

WBC： White blood cell; LYM： Lymphocyte; PLT： Platelet; HCT： Hematocrit; RBC： Red blood cell

**P<0.01vsblank group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;△P<0.05,△△P<0.01vsHedysari group;●P<0.05,●●P< 0.01vsAstragalus group;○P<0.05,○○P<0.01vsHedysari-Angelica group

2.2 对小鼠骨髓有核细胞、网织红细胞的影响

与空白组比较，模型组小鼠中RC、MK均显著降低(P<0.01)，结果表明模型复制成功。与模型组比较，阳性对照组、红芪-当归组、黄芪-当归组可显著升高RC、MK的含量(P<0.01)，红芪组可升高网织红细胞数(P<0.05)。实验结果表明阳性对照组改善骨髓的造血功能较优、较强，给药组中红芪-当归组、黄芪-当归组改善骨髓的造血功能较优(表2)。

GroupRC (individual/L)MK (cells/106)Blank control2.95±0.75307.10±34.17Model1.84±0.31∗∗215.70±33.70∗∗Positive control2.36±0.37##282.50±55.16##Hedysari 2.19±0.32#241.20±34.00Astragalus2.05±0.51238.10±40.74Hedysari-Angelica2.52±0.21##△●260.50±25.96##Astragalus-Angelica2.21±0.28#○248.40±31.38#

**P<0.01vsblank group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;△P<0.05vsHedysari group;●P<0.05vsAstragalus group;○P<0.05vsHedysari-Angelica group

2.3 骨股病理切片观察

与空白组比较，模型组股骨中造血细胞疏松，红细胞、巨细胞减少，说明模型复制成功。与模型组比较，红芪、红芪-当归(5∶1)、黄芪-当归(5∶1)中红细胞、巨细胞数目增多，造血细胞排列紧密。红芪、红芪-当归(5∶1)、黄芪-当归(5∶1)可改善骨股的病理状态(图1)。

Fig.1Marrow cell of thighbone in rats observed under the microscopic(HE ×40)

A： Blank group; B： Model group; C： Hedysari group; D： Astragalus group; E： Hedysari-Angelica group; F： Astragalus-Angelica group

2.4 对小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响

与空白组比较，模型组脾脏、胸腺明显萎缩，脾脏及胸腺指数显著降低(P<0.01)，与模型组比较，阳性对照组、给药组红芪、黄芪、红芪-当归、黄芪-当归组可显著升高脾脏及胸腺指数(P<0.01，表3)。

GroupSITIBlank control6.76±0.583.62±0.43Model5.00±0.81∗∗2.95±0.52∗∗Positive control7.92±1.55##3.51±0.46#Hedysari 7.40±0.65##3.41±0.41#Astragalus7.29±0.51##3.42±0.41#Hedysari-Angelica7.87±0.40##△3.48±0.27#Astragalus-Angelica8.92±1.32##△△●●○3.53±0.30#

SI： Spleen Index; TI： Thymus index

**P<0.01vsblank group;#P<0.05,##P<0.01vsmodel group;△P<0.05,△△P<0.01vsHedysari group;●●P<0.01vsAstragalus group;○P<0.05vsHedysari-Angelica group

3 讨论

中医理论认为：引发血虚证病因多为失血过多，或脾胃虚弱，血液生化乏源，或瘀血阻滞新血不生等。血虚证在临床上表现为面色淡白或萎黄，唇舌爪甲色淡，头晕眼花，心悸多梦，手足发麻等。中医认为，髓由先天之精所化生，由后天之精所充养，有养脑、充骨、化血之功，髓居骨中可化生血液。《素问·生气通天论》：“骨髓坚固，气血皆从” 。因此从骨髓造血方面出发可研究血虚证的本质[10]。

CTX是对抗恶性肿瘤重要的化疗药物，但在应用过程中可造成骨髓抑制，血细胞减少等贫血不良反应[11-12]。贫血为中医血虚范畴，中医认为扶正固本，补气养血是其根本。黄芪与当归以5∶1相配的当归补血汤有很好的补血作用，当归为传统的补血养血之品，配以黄芪补气固本，以无形之气化生有形之血。红芪为甘肃的道地药材，有学者采用超滤与醇沉对黄芪与红芪抗脑缺血的影响及红芪多糖对大鼠骨关节炎的影响进行研究[13-14]。由于红芪与黄芪功效相似，均可补气养血，治疗血虚证。本课题旨在研究红芪、黄芪、红芪-当归(5∶1)、黄芪-当归(5∶1)两种单味药物及两种配伍药对应用于血虚证模型后，比较其拮抗骨髓抑制及补血作用的差异。

本课题采用阿胶补血颗粒作为阳性对照组，研究结果表明阳性对照组在改善外周血象及骨髓的造血功能方面均有较好的作用，阳性对照组与给药组比较效果较优，选用驴胶补血颗粒作为阳性对照品合理，准确。给药组中红芪-当归(5∶1)与黄芪-当归(5∶1)相配可拮抗骨髓抑制，增加骨髓有核细胞、网织红细胞数目，并可升高外周血象中白细胞、红细胞及淋巴细胞的数量，各组对环磷酰胺所致骨髓抑制小鼠的血液生理指标均有不同程度的改善作用，补血作用优于红芪、黄芪单味药组，黄芪-当归(5∶1)在外周血象改善方面较优于红芪-当归(5∶1)。中医理论认为：气为血之帅，血为气之母。补血药中需配补气药同用，黄芪与红芪均可补益脾气，脾为气血生化之源，与当归配伍，可增强当归的补血养血作用。本研究从药理学角度探讨红芪、黄芪单味药及与当归配伍药对的补血作用差异，为红芪、黄芪、当归的临床应用提供科学依据。