低氧性肺动脉高压小鼠肺组织apoE蛋白表达的变化及其意义*

刘玲燕， 黄天鹏， 郝家乐， 陈 然， 范小芳， 龚永生， 毛孙忠

(温州医科大学低氧医学研究所， 浙江 温州 325035)

本课题组前期的研究表明：脂质代谢异常参与单纯低氧诱导的小鼠肺动脉高压的形成[1]。载脂蛋白E(apolipoprotein E，apoE)是脂质代谢过程中非常重要的一种载脂蛋白，对血浆胆固醇水平的维持发挥重要作用。研究表明，apoE主要在肝中合成，血管平滑肌细胞也能合成和分泌apoE，apoE能抑制血小板源性生长因子(platelet derived growth factor，PDGF)介导的平滑肌细胞增殖和迁移进而延缓动脉粥样硬化形成[2-3]，已知肺血管平滑肌细胞异常增殖是低氧性肺动脉高压重要的病理学特征[4]，尚不清楚单纯低氧诱导的肺动脉高压形成过程中是否存在apoE表达异常。

本实验通过复制野生型(wild type，WT)小鼠和apoE基因敲除(apoE gene knockout，apoE-KO)小鼠低氧性肺动脉高压模型，观察血浆脂质含量、肺组织apoE和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptor gamma，PPARγ)蛋白表达的变化，旨在探讨低氧性肺动脉高压形成过程中apoE蛋白表达的变化及可能的意义。

1 材料与方法

1.1 实验动物与试剂

SPF级WT雄性C57BL/6小鼠，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，动物许可证号SCXK(沪2017-0063)，SPF级雄性apoE-KO小鼠(以C57BL/6为背景)由美国Feinstein研究所shu fang liu实验室惠赠。小鼠血浆高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)、总胆固醇(total cholesterol，TC)等ELISA试剂盒购自美国Phoenix Pharm Inc.；apoE、PPARγ抗体购自Abcam公司。

1.2 动物模型的制备

SPF级WT雄性C57BL/6小鼠和雄性apoE基因敲除(apoE-KO)小鼠各20只，各随机再分为2组(n=10)：常氧组和低氧组，共4组。低氧组小鼠置于常压低氧舱内(9%～11% O2，CO2<3%，23 h/d)，常规饲料喂养，连续3周；常氧组自由呼吸空气，其它饲养条件与低氧组相同。

1.3 动物处理与标本留取

3周后，称量动物体重，采用异氟烷吸入法麻醉动物，从右侧颈外静脉插管至右心室，经PowerLab生理信号处理系统(AD Instruments Inc.，Australia)记录右心室收缩压(right ventricular systolic pressure，RVSP)，用RVSP来间接反映小鼠肺动脉压。腹动脉取血，装入预冷含肝素的EP管中，离心后取上清，-70℃保存待测血脂含量。

实验结束后放血处死动物，立即取出心脏，分别称取左心室加室间隔(left ventricle plus septum，LV+S)和右心室(right ventricle，RV)的重量，以RV/(LV+S)的重量比来反映右心室肥大情况。每组随机取6只小鼠右肺组织、右肝组织各约100 mg用于提取总蛋白，待测apoE、PPARγ蛋白的表达。

1.4 血浆胆固醇含量检测

ELISA试剂盒检测血浆TC、LDL、HDL含量，按照试剂盒说明书操作。

1.5 组织蛋白表达检测

肺组织或肝组织加RIPA裂解液1 ml，经玻璃匀浆器研磨制备匀浆。经SDS- PAGE Bio-Rad电泳分离(上样总蛋白量为30 μg)，4℃电转膜过夜，封闭后依次加入apoE(1∶200)一抗或PPARγ(1∶400)一抗，二抗，采用超敏型化学发光检测试剂盒，Bio-Rad成像仪拍照成像，用Image Lab 4.0图像分析软件分析处理。以GAPDH为内参照物，计算待测条带吸光度与GAPDH吸光度的相对比值。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 低氧对小鼠RVSP和RV/(LV+S)的影响

低氧组WT小鼠RVSP和RV/(LV+S)较常氧组分别高68%和59%(P均<0.05)，低氧组apoE-KO小鼠RVSP和RV/(LV+S)较常氧组分别高96%和86%(P均<0.05)；常氧组apoE-KO小鼠RVSP和RV/(LV+S)与常氧组WT小鼠相比均无显著性差异(P均>0.05)；而低氧组apoE-KO小鼠较低氧组WT小鼠分别高 29%和24%(P均< 0.05，表1)。

NormoxiaWT apoE-KOHypoxiaWT apoE-KORVSP (mmHg)24.00±6.0026.67±2.4540.41±7.62∗52.34±15.36∗#RV/(LV+S)0.21±0.030.23±0.030.35±0.04∗0.43±0.10∗#

RVSP: Right ventricular systolic pressure;

RV/(LV+S): The weight ratio of right ventricle (RV) to left ventricle plus septum (LV+S)

*P<0.05vsnormoxia;#P<0.05vsWT

2.2 低氧对小鼠血脂含量的影响

低氧组WT小鼠血浆中TC、LDL含量与常氧组相比均无显著性差异(P均>0.05)，而HDL含量及HDL/LDL比值较常氧组分别低17%和40%(P均<0.05)。低氧组apoE-KO小鼠血浆中TC、LDL、HDL含量及HDL/LDL比值与常氧组相比均无显著性差异(P均>0.05)；常氧组apoE-KO小鼠TC和LDL较WT小鼠分别高6倍、2.4倍(P均<0.05)，而HDL和HDL/LDL比值较WT小鼠分别低23%、 78.8%(P均<0.05，表2)。

NormoxiaWT apoE-KOHypoxiaWT apoE-KOTC (mmol/L)2.17±0.3915.28±1.19#2.20±0.1315.85±1.23#LDL (mg/dl)41.97±5.94142.94±9.89#48.38±4.34 143.68±10.20#HDL (mg/dl)31.03±1.3223.84±4.08#25.63±1.25∗25.04±2.11HDL/LDL0.86±0.160.18±0.04#0.52±0.10∗0.18±0.02#

TC: Total cholesterol; LDL: Low density lipoprotein; HDL: High density lipoprotein

*P<0.05vsnormoxia;#P<0.05vsWT

2.3 低氧对WT小鼠apoE、PPARγ蛋白表达的影响

低氧组WT小鼠肺、肝组织中apoE蛋白表达较常氧组分别下调48%和52%(P均<0.05，图1A，1B)，肺组织中PPARγ蛋白表达较常氧组显著下调37%(P<0.05，图1C)。

Fig.1Effects of hypoxia on relative protein expressions of apoE and PPARγ in WT mice

*P<0.05vsnormoxia

2.4 相关性分析

Pearson 相关性分析显示：WT小鼠RVSP与肺组织中apoE和PPARγ蛋白表达的相关性分析表明：RVSP与apoE(r=-0.723，P=0.008)及PPARγ(r=-0.823，P=0.001)蛋白表达呈显著负相关(P均<0.01，图2A，2B)。

Fig.2Correlation analysis of RVSP and apoE, PPARγ protein expression in WT mice

3 讨论

近年来脂质代谢异常在肺动脉高压中的作用备受关注，临床和动物实验表明：肥胖、高脂血症、胰岛素抵抗与肺动脉高压的发生发展密切相关[5-7]。本课题组前期的研究表明：脂质代谢异常参与单纯低氧诱导的小鼠肺动脉高压的形成[1]。apoE是血浆脂蛋白的蛋白质部分，为LDL受体的配体，通过LDL受体由肝摄取胆固醇酯残粒，对血浆胆固醇水平的维持起重要作用，是降低血浆中氧化型LDL含量和抑制血管壁动脉粥样硬化斑形成的保护因子，与高脂血症和冠心病密切相关，目前主要应用于抗动脉粥样硬化方面的研究[8]。作为一种蛋白质因子，apoE还具有抗炎、抗脂质氧化以及抗血小板源性生长因子诱导的平滑肌细胞增殖和迁移等作用[2-3]。研究发现，平滑肌细胞也能合成和分泌apoE，并且apoE通过结合LDL受体相关蛋白和内化PDGFR-β[9-10]，抑制PDGF介导的平滑肌细胞增殖和迁移，进而延缓动脉粥样硬化进程[2]，尚不清楚单纯低氧诱导的肺动脉高压形成过程中是否存在apoE表达异常。

实验结果显示：低氧组小鼠RVSP与RV/(LV+S)较常氧组均显著升高，提示低氧性肺动脉高压小鼠复制成功[11]。同时，低氧组WT小鼠血浆中TC、LDL含量与常氧组相比虽然无显著性差异，但HDL含量和HDL/LDL比值较常氧组显著降低，提示低氧诱导的脂质代谢异常参与低氧性肺动脉高压的形成[1]。令人感兴趣的是，实验结果还显示：低氧组WT小鼠肺组织和肝组织中的apoE蛋白表达较常氧组显著下调，并且RVSP与肺组织apoE蛋白表达呈显著负相关，已知apoE是脂质代谢过程中非常重要的一种载脂蛋白，对血浆胆固醇水平的维持发挥重要作用，apoE主要在肝中合成，肝脏产生的apoE约占全身产量的75%，提示肺组织apoE蛋白表达下调可能参与低氧性肺动脉高压的形成。低氧诱导肺组织apoE蛋白表达下调可能与低氧诱导肺组织PPARγ蛋白表达下调有关[12]，也可能与低氧下调肝组织apoE蛋白表达，减少apoE合成有关，具体机制有待进一步阐明。

为进一步说明apoE在单纯低氧诱导的肺动脉高压形成过程中的意义，我们同时选用apoE-KO小鼠复制低氧性肺动脉高压，实验结果显示：低氧组apoE-KO小鼠RVSP与RV/(LV+S)较常氧组均显著升高，同时低氧诱导apoE-KO小鼠肺动脉高压和右心室肥厚程度较低氧诱导WT小鼠的更为明显，表明apoE基因缺陷促进单纯低氧诱导小鼠肺动脉高压的形成，进一步提示低氧性肺动脉高压形成与肺组织apoE蛋白表达下调有关。有关外源性apoE是否具有防治低氧性肺动脉高压的作用，apoE防治低氧性肺动脉高压具体的分子机制有待进一步的研究。

实验结果还显示，低氧组WT小鼠肺组织PPARγ蛋白表达较常氧组显著下调，且RVSP与肺组织PPARγ蛋白表达呈显著负相关，这与Gong等[12]的研究结果相符，提示低氧性肺动脉高压形成与肺组织中PPARγ表达下调有关。PPARγ是一类配体活化的核转录因子，主要参与调节糖脂质代谢，在脂肪细胞分化、动脉粥样硬化、肺动脉高压等中发挥重要作用。研究表明，PPARγ激动剂——罗格列酮可改善低氧诱导的野生型小鼠肺动脉高压和右心室肥厚[13]，血管平滑肌细胞特异性PPARγ基因缺陷小鼠更容易自发形成肺动脉高压和右心室肥厚，已知apoE编码基因APOE是PPARγ的靶基因之一，罗格列酮可刺激肺血管平滑肌细胞分泌apoE进而发挥抑制PDGF介导的肺平滑肌细胞增殖作用[14]，提示肺动脉高压的形成与PPARγ/apoE通路异常有关；而有研究表明，罗格列酮可改善高胆固醇膳食喂养诱导的apoE-KO小鼠肺动脉高压和右心室肥厚[6]，我们前期的实验亦发现，低氧可上调apoE-KO小鼠肺组织PPARγ蛋白表达，apelin改善低氧诱导的apoE-KO小鼠肺动脉高压和右心室肥厚作用可能与上调肺组织PPARγ蛋白表达有关[11]，提示PPARγ激动剂改善肺动脉高压与PPARγ/apoE通路无关，这可能与所选的动物品系、实验条件不同有关。由于高脂膳食喂养可引起血脂、apoE代谢异常，且apoE-KO小鼠本身就存在apoE基因表达缺陷、血脂异常(实验结果显示apoE-KO小鼠TC和LDL较WT小鼠显著升高，而HDL和HDL/LDL比值显著降低)，并不能真实反映PPARγ/apoE通路在低氧性肺动脉高压形成中的作用，低氧诱导apo-KO小鼠肺组织PPARγ表达上调可能是一种代偿反应，PPARγ/apoE通路在单纯低氧诱导的肺动脉高压形成中的作用有待进一步阐明。

综上所述，低氧诱导肺组织apoE蛋白表达下调，肺组织apoE蛋白表达下调参与低氧性肺动脉高压的形成。