利用赤霉素提高微藻耐酸性的研究

史飞飞，程宇娇，马浩天，程蔚兰，宋程飞，李润植

(山西农业大学 分子农业与生物能源研究所，山西 太谷 030801)

工厂中化石燃料的燃烧是造成温室效应的主要因素，因此工厂烟道气中CO2的减排是缓解温室效应的关键。国内外有关专家针对CO2的减排提出很多方法，如利用物理化学方法进行吸收、捕集CO2用于工厂或封存等。而近年来利用生物减排取得很大进展，尤其是微藻固定CO2技术是目前世界上最主要和最有效的固碳方式之一，从长远角度考虑，也是一种经济可行、环境友好和可持续性发展的CO2固定技术[1]。微藻的固碳效率是普通陆生植物的10～50倍，而且微藻具有生长周期短、适应环境能力强、不占用耕地面积等优势[2]。微藻还可以直接利用烟道气中的碳源和氮源等作为其生长所需要的的营养原料，而且最后收集的藻体可以作为生产高附加值产品和生物柴油的原料。Chae等[3]利用微藻固定烟道气中的CO2的同时并生产富含高蛋白动物饲料,并取得很好的效果。 Israel等[4]利用烟道气中CO2培养红海藻，不仅固定了CO2而且使红海藻培养成本大大降低。诸多应用微藻固定烟道气CO2的研究表明利用微藻减排是一种经济可持续的措施。

利用微藻固定烟道气中CO2对于控制全球的温室效应具有重要的意义，但是也存在一定的局限性。来自电厂和煤炭企业的烟道气中除含有较高的浓度的CO2外，SOx和NOx等酸性气体的浓度也很高。当烟道气通入培养液时会导致其pH急剧下降，进而影响微藻的生长和固碳效率，因此解决培养液酸化问题是顺利进行微藻固定烟道气中CO2的关键。Jiang等[5]利用空气来稀释烟道气降低酸性氧化物的浓度，添加碱性物质到培养液和通过pH反馈控制计来控制烟道气的通入量等来降低培养液的酸化对微藻生长的影响。然而这些方法的应用增加了微藻固碳体系的成本或者降低了微藻利用烟道气的效率，而且也不能从根本上解决培养液酸化对微藻生长的影响。要从根本上解决酸性环境对微藻生长的抑制作用，通过调控技术提高藻种耐酸性或培育抗酸性的微藻藻株是一个有效措施。孟范平等[6]从12种海洋微藻中筛选出了能够耐酸性和耐高浓度CO2的小新月菱形藻和海水小球藻。Yue等[7]在电厂附近的水体中分离出一株藻株，可以在70% CO2下生存，具有良好的耐酸性。Jiang[8]通过酸驯化使得栅藻可以在pH 2.5的环境生存。

本试验首先从藻种库中筛选出一株耐酸性的藻种，然后通过添加一定量赤霉素来进一步提高该筛选藻种的耐酸性，试验结果证明向培养液中添加一定量的赤霉素可以极大的提高微藻在低pH环境下的生长速率，也提高了微藻在极低pH的生存能力。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 微藻藻种

试验所需要用到的藻种：小球藻、斜生栅藻、雨生红球藻、三角褐指藻、微拟球藻、莱茵衣藻。其中，小球藻从山西农业大学思想湖分离纯化；斜生栅藻从山西一煤电厂附近水体采集的水样分离纯化；雨生红球藻和莱茵衣藻从中国科学院水生所购买；三角褐指藻由中科院海洋所赠送；微拟球藻由山西大学谢树莲老师实验室赠送。

1.1.2 培养基

小球藻、斜生栅藻、雨生红球藻、微拟球藻和莱茵衣藻所用的培养基为BG11培养基，配方组成为：NaNO31 500 mg·L-1，CaCl236 mg·L-1，K2HPO4·3H20 52.5 mg·L-1，Na2CO320 mg·L-1，MgSO436.6 mg·L-1，C6H8O76.6 mg·L-1，Na2EDTA·2H2O 1.1 mg·L-1，FeC6H5O7NH4OH 6 mg·L-1，H3BO32.86 mg·L-1，MnCl2·4H2O 1.81 mg·L-1，CuSO4·5H2O 0.08 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.22 mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.39 mg·L-1。三角褐指藻所用的培养基为f/2培养基，配方组成为：NaNO375 mg·L-1，NaH2PO4·H2O 5 mg·L-1，Na2SiO3·9H2O 20 mg·L-1，Na2EDTA 4.36 mg·L-1，FeCl3·6H2O 3.16 mg·L-1，CuSO4·5H2O 0.01 mg·L-1，ZnSO4·7H2O 0.023 mg·L-1，CoCl2·6H2O 0.012 mg·L-1，MnCl2·4H2O 0.18 mg·L-1，Na2MoO4·2H2O 0.07 mg·L-1，维生素B1 0.1 μg·L-1，维生素B12 0.5 μg·L-1，生物素0.5 μg·L-1。

1.2 方法

1.2.1 标准培养条件

将处于对数生长期的200 mL种子藻(1 g·L-1)接种到装有700 mL培养基的柱状玻璃生物反应器中，温度设置为25 ℃，二氧化碳浓度为1%，通气速率为80 L·h-1，光照强度7 000 lx。

1.2.2 模拟烟道气酸化条件

工厂排放的烟道气存在运输存放的困难，不利于试验的进行。试验采用模拟工厂烟道气的组分来替代工厂排放的烟道气，在100 L的钢瓶中装有15% CO2、150 mg·L-1NO、300 mg·L-1SO2和一定体积的N2。

1.2.3 赤霉素对微藻生长的试验

按每升培养液添加0、5、10、15、25、30 mg 6个赤霉素浓度梯度，每个梯度设置3个重复。

1.3 数据分析

所有的实验的数据表示3次重复实验的平均值，并用SPSS软件进行显著性分析。。

2 结果与分析

2.1 不同藻株耐酸性的比较

为了先寻找一株耐酸性较强的藻株，把藻种库中的6种藻种接种在初始pH 3的环境中，通过观察其生长状况来判断其耐酸性。如图1a所示，在初始pH 3条件下， 三角褐指藻、莱茵衣藻、紫球藻和雨生红球藻的生长均受到明显的抑制，几乎不生长，而小球藻和栅藻虽在生长初期生长初期缓慢，但其后摆脱酸性的抑制从而可以正常生长。与小球藻相比较，栅藻在酸性条件下生长速率快，适应酸性环境能力强。图1-b中显示的是在初始pH 3条件下6种藻种的pH变化曲线，三角褐指藻、莱茵衣藻、紫球藻和雨生红球藻的pH几乎没有变化。而栅藻的pH的回升速度最快，小球藻次之。因此，6种藻种中栅藻适应酸性环境的能力最强，在后期的试验中以栅藻为模式藻来进一步提高其耐酸性。

图1 6株不同藻株在初始pH 3.0下的生长曲线(a)及pH变化曲线(b)Fig.1 The growth curve (a)and the pH change(b) of six algal strains at initial pH of 3.0

2.2 酸性条件下赤霉素浓度对于栅藻生长的影响

图2所示为不同赤霉素浓度下栅藻在初始pH 3.0环境下的生长和pH状况。图2-a所示，与未添加赤霉素的栅藻比较，大部分添加赤霉素的的栅藻在生长初期能更快的适应酸性环境。而未添加赤霉素的栅藻在生长初期有明显的延滞期，在培养12 d时，添加赤霉素的栅藻的生物量明显大于没有添加赤霉素的栅藻。其中，添加10 mg·L-1赤霉素的栅藻在生长初期延滞期最短，在培养12 d时其生物量达到最大，其适应酸性的环境最强。但添加25 mg·L-1赤霉素的栅藻与0 mg·L-1的栅藻的生长并没有明显区别。由图2-b所见，与没有添加赤霉素的栅藻比较，添加5、10、15、20 mg·L-1赤霉素的栅藻的pH回升速度快，尤其是添加10 mg·L-1赤霉素的栅藻的pH回升速度最快，与对照差异极显著(P<0.01)。

图2 不同赤霉素浓度下栅藻在初始pH 3下的生长曲线(a)及pH变化(b)Fig.2 The growth curve (a)and the pH change(b) of Scenedesmus at different gibberellin concentrations

在初始pH 3的条件下，添加10 mg·L-1赤霉素的栅藻的生长速率最快，其pH回升速度最快，因此在后期的实验中以10 mg·L-1浓度的赤霉素为初始浓度来提高栅藻的耐酸性。

2.3 模拟烟道气环境及烟道气环境下栅藻的生长状况

为了解烟道气在通入培养液时的培养液的酸性强度，将模拟烟道气通入只含BG11的培养液中，测定BG11培养液pH。如图3所示，在通入烟道气10 h时pH就下降到3.5左右，15 h后pH稳定在2.5左右。培养液的酸化正是由于烟道气中高浓度的CO2和氮硫氧化物引起的，会严重影响微藻的生长。

图3 通入模拟烟道气导致培养液pH变化的曲线Fig.3 The pH change in medium aerated by the simulated flue gas

图4 栅藻在初始pH 2.5 条件下的pH变化曲线(a)和生长曲线(b)Fig.4 The pH change (a)and the growth curve (b) of Scenedesmus at initial pH of 2.5

在上面试验中我们筛选出以栅藻为模式藻种，对添加的赤霉素初始浓度进行了优化即添加10 mg·L-1赤霉素。为了获得适应烟道气的藻种，将栅藻接种在初始pH 2.5的环境下进行培养。

由图4-a所示，在初始pH 2.5的酸性环境中，未添加赤霉素和添加赤霉素的栅藻在培养初期其pH几乎没有明显变化，差异不显著(P≥0.05)。当培养到第4天开始，添加赤霉素的栅藻pH迅速回升，而未添加赤霉素的栅藻在整个培养周期都没有太大变化，差异极显著(P<0.01)。说明添加了赤霉素的栅藻有很强的pH调节能力。由图4b所示，在pH 2.5 的酸性环境中，未添加赤霉素的栅藻的生长完全受到了抑制，而添加赤霉素了的栅藻虽在培养前3天生长缓慢，当到第4天迅速生长。

3 讨论与结论

工厂排放的烟道气给环境造成了严重的伤害，利用微藻固碳技术是一种经济可行、环境友好和可持续性的CO2固定技术。而利用微藻介导生物固碳技术进行CO2减排在实际应用时却存在局限性。烟道气中含有高浓度的CO2和氮硫氧化物，通入培养液时会造成培养液急剧酸化，而培养液的pH是影响自养微藻生长和固定CO2效率的重要因素。Sung等[9]在25 ℃培养条件下研究了不同pH对于小球藻的影响，结果证明在pH 3.5的条件下微藻的生长就会受到抑制。刘琪[10]把栅藻接种在初始pH 3.6的培养液中，结果2 d后发现生物量没有上升反而下降了60.6%，而且大部分藻细胞褪色开始死亡。由于烟道气通入培养液导致培养液的pH下降到3以下，因此烟道气引起培养液的酸化是制约微藻利用烟道气生物固碳的主要原因。

为了克服烟道气通入培养液造成的酸化问题，前人从藻种方面出发筛选出了耐酸性的藻种或者耐氮硫氧化物的藻种[11～13]，但这些藻株能够适应的最大的SO2浓度是0.015%。而且烟道气本身显酸性不利于溶解在酸性培养液中，使得烟道气的利用效率不高[14]。保证微藻生长的pH适宜环境是克服烟道气导致培养液酸的有效途径，前人通过一系列调控手段来使得培养液的pH既适宜微藻的生长又不阻碍烟道气的溶解。蒋银莉[15]通过向藻液中添加碱性物质来中和酸，如碳酸钙和氢氧化纳。添加氢氧化钠和碳酸钙虽解决了基质酸化的问题，但又存在局限性和其它问题。添加氢氧化纳因为成本问题不可能大规模应用，而且会导致藻液产生高离子压不利于微藻的生长[16，17]。而添加碳酸钙在微藻后期的采收中又存在很大困难，如后期分离碳酸钙和硫酸钙沉淀。蒋银莉还采用pH自动反馈机制来调节藻液的pH，通过控制烟道气的进气量从而控制pH。pH反馈控制虽是抑制藻液酸化的有效途径，但其也降低了微藻对烟道气的使用量。

本试验首先从藻种库中筛选一株耐酸性藻株，分别对小球藻、斜生栅藻、雨生红球藻、三角褐指藻、微拟球藻和莱衣依藻进行耐酸性测试。将这6株藻分别接种在初始pH 3的环境中，结果发现栅藻的延滞期最短，生长最好，而其它5株藻受抑制比较严重(图1)。栅藻虽然在生长初期延滞期最短，但是还存在一定程度的抑制。已有研究显示, 培养液pH的变化与接入微藻的生长快慢存在一定的关系。微藻本身光合作用及其生长可调节藻液pH, 藻液pH的改变反过来也影响微藻的光合和生长过程。高文涛等[18]发现微藻光合作用中碳酸酐酶起催化作用, 并会产生OH-, 产生的OH-被输送到细胞外, 导致藻液pH升高。因此本试验期望通过添加赤霉素来促进栅藻的生长来调节pH,从而缩短生长初期的延滞期。然而赤霉素存在高浓度抑制生长和低浓度促进生长的情况，所以本试验研究了在初始pH 3条件下不同赤霉素浓度对于栅藻的影响，结果证明添加10 mg·L-1赤霉素的栅藻pH回升速度最快，生长最快，延滞期最短(图2)。

本研究的目的是为了使得微藻适应烟道气通入藻液时的环境，于是通过模拟烟道气通入培养基来判定其导致的酸性强度。试验把模拟烟道气通入培养液中，测得其pH在2.5左右，因此把栅藻和添加10 mg·L-1赤霉素的栅藻接种在初始pH 2.5的环境中。结果发现无添加赤霉素的栅藻在整个培养期生长和pH几乎没有变化，藻液在第2天就变白，而添加赤霉素的栅藻虽在培养初期生长缓慢，但是在pH慢慢回升后其生长速度加快(图4)。

本研究从实际生产应用出发，以提高栅藻适应烟道气通入藻液造成的低pH环境为目标，从而建立了通过添加一定浓度的赤霉素来提高栅藻的耐酸性的简便方法。添加赤霉素能显著增强微藻在接入低pH培养液的抗酸性能力，并且促进栅藻的生长和使藻液pH迅速上调，确保微藻固定烟道气体系的正常运转。

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