杜氏盐藻DsFAD2基因的鉴定及缺氮胁迫下表达分析

宋亚楠，安茜，岳敏，赵熙宁，刘宝玲，薛金爱，李润植

(山西农业大学 分子农业与生物能源研究所，山西 太谷 030801)

ω-6脂肪酸去饱和酶(FAD2)是一种普遍定位于内质网的膜结合型酶蛋白[1]，能够催化油酸(18∶1Δ8)在第12个C原子位置脱氢形成双键进而生成亚油酸(18∶2Δ9, 12)。该酶控制着植物细胞内油酸、亚油酸及其它多不饱和脂肪酸的积累量。亚油酸(18∶2Δ9, 12)是人体必需的脂肪酸，能降低血液中胆固醇的含量，但其具有2个双键，很容易氧化，使植物油产生酸败，进而影响人体健康。相反，单不饱和油酸(18∶1Δ9)氧化稳定性比亚油酸高10倍[2]，同样能显著降低血液中的胆固醇含量。因此，培育对人体有益的富含油酸的植物油越来越受到人们的关注。现已在棉花[1,3]、玉米[4]、紫苏[5]、油棕[6]、花生[7]和大豆[8,9]等多种植物中成功克隆并验证了FAD2基因的功能。通过反义RNA技术抑制大豆FAD2基因的表达，能显著提高油酸的合成，培育获得种子富含油酸的大豆种质[10]。同样，通过RNA i技术抑制棉花FAD2基因的表达，可使棉籽油酸的含量提升到77%，而亚油酸含量由60%降为4%[11]。研究表明，在高等植物细胞中，遗传修饰其内源FAD2基因表达水平可有效调控细胞中油酸及亚油酸的比例。

Chi等[12]已经从低等植物莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)中成功克隆并鉴定了CrFAD2基因。Lu等[13]也已经从小球藻(Chlorella vulgaris)中克隆了CvFAD2基因，通过酵母异源表达检测到通常不存在于野生型酵母细胞的油酸(18∶2)的合成，验证了CvFAD2基因的功能。杜氏盐藻(Dunaliella salina)是一种无细胞壁的单细胞真核绿藻，藻细胞中油脂含量可高达到36%～42%[14]，其脂肪酸组成包括饱和脂肪酸，以及油酸、亚油酸和亚麻酸等不饱和脂肪酸[15]，是食用和工业用(生物柴油及油脂化工品)油脂的珍贵资源。特别是盐藻能在高盐的水体中生长，可低成本规模化养殖、且不易发生有害生物污染。养殖盐藻日渐成为商业化生产高值油脂和盐碱水体资源化利用的一条绿色可持续的路径。然而，有关盐藻油脂合成代谢及其调控分子机制还不清楚。

为此，本文选取参与控制单不饱和脂肪酸与多不饱和脂肪酸合成比例的FAD2(fatty acid desaturase 2)酶基因为靶标，以运城盐湖分离的富油盐藻株系(YC-011)为试材，利用高保真PCR技术克隆盐藻DsFAD2基因，并应用生物信息学方法详尽分析DsFAD2编码蛋白的理化性质、跨膜区域、3D高级结构及氨基酸保守基序和系统进化等特征，进一步应用qRT-PCR分析DsFAD2在缺N胁迫下的表达模式，解析其生物学功能。

1 材料与方法

1.1 生物材料

本实验室从运城盐湖分离纯化获得一株富油杜氏盐藻株系(YC-011)，培养并保存于山西农业大学能源微藻种质库。使用DM培养基，在25 ℃，2 000 lx，12 h/12 h光照培养条件下培养杜氏盐藻YC-011。

1.2 氮(N)胁迫处理

将杜氏盐藻(YC-011)在DM培养基正常培养8 d后，通过8 000 r·min-1离心3 min收集藻细胞，并重新悬浮在不含N源的DM培养基中，缺N培养8 d。为了研究杜氏盐藻DsFAD2在缺N胁迫下的转录水平，分别取在缺N培养基中培养1，2，4，8 d的藻细胞样品提取总RNA。未缺N处理的藻细胞样品在正常条件下培养1，2，4，8 d作为对照。

1.3 总RNA提取及cDNA合成

分别取不同处理下的盐藻培养物，离心收集藻细胞。使用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒提取藻细胞总RNA，用5X All-In-One RT Master Mix (with AccuRT Genomic DNA Removal Kit)反转录获得cDNA。

1.4 PCR克隆杜氏盐藻FAD2编码序列

依据已有盐藻FAD2基因序列(Dusal.0482s00008.1)设计PCR引物：FAD2-F：AAAATGGGAGCAGGTGGACA；FAD2-R：ACAGAGGAGCATGACAACGA。以YC-011株系藻细胞的总RNA为模板，用高保真PCR扩增DsFAD2编码序列，测序获得DsFAD2的cDNA序列，并推测其编码蛋白序列。

1.5 qRT-PCR检测DsFAD2在缺N胁迫下的表达

从NCBI上获得内参基因GAPDH(EU447774.1)，用Primer 3 Input(http://primer3.ut. ee/)在线网站设计Real-time PCR的引物：DsFAD2-F：5’-GTACTGGTTTTGGCAGGGTG-3’，DsFAD2-R：5’-CCACAGTGTCATTCAGCCAC-3’；GAPDH-F：5’-ACATGGTCAAGGTTG TTGCC-3’，GAPDH-R：5’-CAGGTGGTGATGGAAGAGGT-3’。使用EASY spin植物RNA快速提取试剂盒提取总RNA，通过5X All-In-One RT MasterMix (with AccuRT Genomic DNA Removal Kit)获得cDNA。qRT-PCR 使用EvaGreen 2X qPCR Master Mix，用CFX96 Real-time PCR Detection System进行real-time PCR反应，每个样品重复3次。PCR反应程序为：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，40个循环。以内参基因GAPDH为对照，通过Excel和SPASS处理相对表达量并绘制柱状图。

1.6 DsFAD2蛋白理化特性的生物信息学分析

利用ExPasy提供的ProtParam在线工具(http://web.expasy.org/protparam/)分析杜氏盐藻DsFAD2蛋白的氨基酸组成、理论等电点和疏水指数等理化性质。利用CBS Prediction Servers在线网站(http://www.cbs.dtu.dk/services/)的NetPhos工具分析该蛋白磷酸化位点；利用TMHMM Server工具来预测该蛋白的跨膜区域(http://www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/)。利用HNN secondary structure prediction在线工具预测杜氏盐藻DsFAD2蛋白的二级结构(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_hnn. html)；利用同源建模法，采用Intensive模式，使用Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/ phyre2/html/page.cgi?id=index)预测上述蛋白三级结构。利用IBIVU Server(http://www.ibi. vu.nl/programs/pralinewww/)对杜氏盐藻DsFAD2蛋白和其它5种不同物种的FAD2蛋白进行氨基酸序列比对。使用MEGA7.0软件对杜氏盐藻DsFAD2蛋白和另外19种不同物种的FAD2蛋白进行ClustalW的多序列比对，采用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树,自举检验值设为1 000个循环。

2 结果与分析

2.1 运城盐藻株系(YC-011)DsFAD2基因编码序列(ORF)的克隆

依据已知盐藻FAD2序列设计引物，用YC-011总RNA制备的cDNA为模板，应用高保真PCR克隆获得YC-011盐藻株系DsFAD2基因的编码序列，测序结果证明，克隆到DsFAD2基因的完整ORF(1 143 bp)，推测的蛋白序列与参考序列完全一致(380aa)(图3)。

2.2 杜氏盐藻DsFAD2蛋白的结构特征分析

2.2.1 杜氏盐藻DsFAD2蛋白的理化性质和磷酸化位点分析

本文以拟南芥AtFAD2为对照，对杜氏盐藻DsFAD2酶蛋白理化性质分析(表1)表明，DsFAD2的相对分子量为43.43 kDa，其中氨基酸含量最高的是Ala(10.3%)、次之为Val(8.9%)，含量较低的是Met(2.1%)和Cys(1.3%)。理论等电点为7.78，小于AtFAD2的pI值。DsFAD2不稳定系数为42.17，高于AtFAD2(37.93)。DsFAD2蛋白平均亲水性指数为-0.082，说明其亲水性差，属于疏水性蛋白。磷酸化预测发现：DsFAD2丝氨酸激酶(Ser)的磷酸化位点最多，为15个，在N端分布比较紧密。络氨酸激酶(Tyr)的磷酸化位点为4个，磷酸化最高得分小于其他两种激酶(Ser和Thr)。16位的丝氨酸预测分值最高，为0.998，在此处磷酸化可能性最大。另外，络氨酸激酶(Tyr)的磷酸化位点远少于AtFAD2(12个)，且磷酸化最高得分也较小，预测在络氨酸处磷酸化的能力较低。DsFAD2的总磷酸化位点数(27个)明显少于AtFAD2(40个)。可能在藻类中催化油酸变为亚油酸的过程仅需较少的磷酸化就可以完成。

2.2.2 杜氏盐藻DsFAD2跨膜结构

跨膜结构预测发现DsFAD2酶蛋白在内质网膜上由内到外有5个跨膜螺旋区，其对应的跨膜位置为 i52-72o82-104i116-138o177-199i231-253o(如图1：“o”代表膜外，“i”代表膜内)。与AtFAD2的跨膜区(o54-76i83-105o115-137i174-196o223-245i252-274o，6个)相比，跨膜区数少一个。DsFAD2酶蛋白N端位于内质网膜内侧，C端处于细胞质中，而AtFAD2酶蛋白N端、C端均暴露于细胞质中。DsFAD2前5个跨膜区位置与AtFAD2非常相近。预测其在藻类中发生催化作用的路径相似，但是跨膜方向相反，紧连第5个跨膜区的一段序列嵌入内质网膜中，可能与形成底物结合位点不同有关。

表1 DsFAD2和AtFAD2的理化性质和磷酸化位点分析

Table1 Analysis on physical chemical properties and phosphorylation sites of DsFAD2 and AtFAD2

蛋白名称Proteinname盐藻FAD2DsFAD2拟南芥FAD2AtFAD2蛋白长度/aa380383相对分子量/kD43.4344.05理论等电点/pI7.788.39不稳定系数42.1737.93脂肪系数85.4783.52总平均亲水性指数-0.082-0.094Ser磷酸化位点数1518Thr磷酸化位点数810Tyr磷酸化位点数412磷酸化位点总数2740

2.3 DsFAD2酶蛋白高级结构分析

对DsFAD2蛋白进行二级结构预测结果(图2)表明，该蛋白的二级结构中主要为α螺旋和无规则卷曲，比例分别为46.84%和42.89%。β片层所占比例最少，为10.26%。与AtFAD2的结构(α螺旋：43.60%，无规则卷曲：46.48%)相比，各成分所占比例相差不大。α螺旋所在位置(51～72,81～105, 182～199,226～244,255～273)与上述跨膜区预测结果基本一致。用同源建模的方法预测杜氏盐藻DsFAD2酶蛋白的三级结构显示，DsFAD2预测的氨基酸范围为71%(估测率大于90%)，与AtFAD2结构相似。

图1 DsFAD2和AtFAD2的蛋白跨膜螺旋区预测Fig.1 Prediction of protein transmembrane helix region of DsFAD2 and AtFAD2

图2 DsFAD2和AtFAD2的三级结构预测Fig.2 The third structure Prediction of DsFAD2 and AtFAD2

2.4 杜氏盐藻DsFAD2蛋白的氨基酸序列分析及系统发育分析

氨基酸序列比对结果表明，杜氏盐藻DsFAD2酶蛋白也具有其他物种FAD2酶蛋白所具有的3个保守的组氨酸富集区，分别为HisboxⅠ：WVIAHECGH，HisboxⅡ：SHRRHH和HisboxⅢ：DTHVAHHLFS(图3)，分别位于93～111、142～147和315～321位氨基酸，能形成与铁离子结合的酶活性催化中心，且在279(Ser)位和315(Thr)位处有2个磷酸化位点，可能调控该蛋白的催化活性。另外，杜氏盐藻DsFAD2没有检测到KKXX-like motif内质网滞留信号，但是在序列C端发现一段富含芳香族氨基酸的保守序列“VYWY”(378～381位氨基酸)。已有研究指出，C端富含芳香族氨基酸保守序列能将FAD2酶蛋白滞留在内质网中[16]。因此，DsFAD2的C端保守序列“VYWY”具有类似内质网滞留信号的作用。综合分析说明DsFAD2酶蛋白为膜结合蛋白，定位于内质网膜上。

图3 各物种FAD2蛋白的氨基酸序列比对Fig.3 The aligment of FAD2 proteins of different species

利用MEGA 7.0软件对YC-011杜氏盐藻株系DsFAD2蛋白和已报道的17个物种的FAD2蛋白构建系统进化树(图4)。结果表明，进化树中所采用的18个物种的FAD2蛋白可分为陆生植物和藻类两大支。杜氏盐藻与亚麻荠等陆生植物的FAD2蛋白亲缘关系比较远，与莱茵衣藻和团藻的亲缘关系较近。

图4 各物种FAD2蛋白的系统发育分析Fig.4 Phylogenetic analysis of FAD2 proteins of different species 注：各物种FAD2蛋白的序列登录号：拟南芥AtFAD2(NP_187819.1)，莱茵衣藻CrFAD2(XP_001691669.1)，团藻VcFAD2(XP_002955859.1)，亚麻荠CsaFAD2(ADU18247.1)，大豆GmFAD2(BAD89862.1)，小球藻CvFAD2(ACF98528.1)，芍药PlFAD2(AKE44629.1)，亚麻LuFAD2(ACF49507.1)，克莱门柚CcFAD2(XP_006445919)，橙子CsiFAD2(XP_006492662)，甜瓜CmFAD2(XP_008443062.1)，芝麻SiFAD2(AAF80560)，葡萄VvFAD2(XP_002285640)，陆地棉GhFAD2(AAL37484.1)，甘蓝型芥菜BniFAD2(ADJ58018.1)，缺刻叶球藻LiFAD2(AEU04701.1)，甘蓝型油菜BnaFAD2(ACP39505.1)Note：Accession number of various FAD2 protein sequences:Arabidopsis thaliana AtFAD2(NP_187819.1)，Chlamydomonas reinhardtii CrFAD2(XP_001691669.1)，Volvox carteri f. Nagariensis VcFAD2(XP_002955859.1)，Camelina sativa CsaFAD2(ADU18247.1)，Glycine max GmFAD2(BAD89862.1)，Chlorella vulgaris CvFAD2(ACF98528.1)，Paeonia lactiflora PlFAD2(AKE44629.1)，Linum usitatissimum LuFAD2(ACF49507.1)，Citrus clementina CcFAD2(XP_006445919)，Citrus sinensis CsiFAD2(XP_006492662)，Cucumis melo CmFAD2(XP_008443062.1)，Sesamum indicum SiFAD2(AAF80560)，Vitis vinifera VvFAD2(XP_002285640)，Gossypium hirsutum GhFAD2(AAL37484.1)，Brassica nigra BniFAD2(ADJ58018.1)，Lobosphaera incisa LiFAD2(AEU04701.1)，Brassica napus BnaFAD2(ACP39505.1)

2.5 缺氮胁迫下杜氏盐藻DsFAD2的表达分析

以正常培养的杜氏盐藻(YC-011)样品作为对照，通过qRT-PCR分析DsFAD2的mRNA相对表达丰度(图5)。结果表明，在正常和缺N培养条件下，随着培养时间延长，DsFAD2的表达量均有明显变化。在正常培养条件下第2天时，DsFAD2表达量上升，在第4天时开始下降，到第8天时其表达量为第1天时的67%。在缺N培养条件下，第1天时与对照相比，DsFAD2表达减低16%，从第2天开始，DsFAD2表达逐渐增高，到第8天时其表达量为第1天时的2.2倍，是对照的2.8倍。由此可知，缺N胁迫显著诱导DsFAD2基因的上调表达。

3 讨论

ω-6脂肪酸去饱和酶2(FAD2)催化油酸形成亚油酸，是多不饱和脂肪酸合成的限速酶和决定细胞脂肪酸组成的一个关键因素。因此，通过调控FAD2基因的表达来调控细胞中饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸的比例，能改善油脂品质，满足人类对油脂的各种需求。鉴定杜氏盐藻DsFAD2基因和表达模式，对探究盐藻油脂合成积累及其调控的分子机制具有重要意义，也能为后续进行敲除或RNAi干扰该基因表达，以期改变其脂肪酸组成，进而获得高油酸杜氏盐藻新种质提供科学依据。

本文以本实验室分离获得富油杜氏盐藻YC-011株系为试材，克隆到DsFAD2完整的ORF序列。生物信息学分析表明，杜氏盐藻DsFAD2为膜结合蛋白，其二级结构主要由α螺旋和无规则卷曲构成，这与跨膜区预测结果基本一致，也体现在三级结构中。FAD2酶蛋白不同位置的跨膜螺旋区是实现催化作用的结构保障[17]，DsFAD2酶蛋白的后四个跨膜螺旋区位于脂肪酸去饱和酶结构域所在位置，为形成特定的底物结合位点提供了结构基础。不同物种FAD2酶蛋白跨膜区数目的不同对酶活性的影响还未有相关研究报道，可能由遗传背景决定。DsFAD2酶蛋白和其他物种FAD2一样都含有3个组氨酸富集区，能够形成DsFAD2酶蛋白活性中心，以及相应铁离子的结合位点。另外，杜氏盐藻DsFAD2有一段富含芳香族氨基酸的保守序列“VYWY”，将该蛋白定位于内质网膜上，从而推测有利于催化作用的高效进行。

qRT-PCR分析表明，DsFAD2的表达量在缺N胁迫下显著上调表达，预示着DsFAD2参与藻细胞N胁迫响应。前期研究发现，缺N胁迫培养明显促进藻细胞油脂积累，在胁迫8 d时，藻细胞油脂含量为对未胁迫对照的2倍多，且亚油酸(C18∶2)含量上升为对照的3倍多，而饱和脂肪酸即棕榈酸(C16∶0)和油酸(C18∶0)含量下降。显然，DsFAD2的上升表达导致藻细胞脂肪酸不饱和度提高，增加了细胞生物膜的流动性，从而增强藻细胞的抗逆性。目前，对杜氏盐藻DsFAD2的研究尚浅，未来需深入解析盐藻响应N胁迫的信号分子以及激活DsFAD2表达的分子网络。

4 结论

本研究成功克隆杜氏盐藻(YC-011)DsFAD2基因，生物信息学分析表明：DsFAD2蛋白定位于内质网中，有5个跨膜区、3个组氨酸保守区和芳香族氨基酸序列，与莱茵衣藻、团藻亲缘关系最近。另外，DsFAD2参与杜氏盐藻N胁迫响应，促进油脂的合成和积累。本研究不仅为进一步解析N胁迫条件下藻细胞油脂富集及响应分子机制提供了科学参考，还为改良YC-011盐藻油脂品质、培育有不同用途的富油YC-011株系，以及建立高效规模化培养杜氏盐藻技术体系，生产优质高值油脂提供了科学依据。

[1] Zhang D,Pirtle IL,Park SJ,et al.Identification and expression of a new delta-12 fatty acid desaturase (FAD2-4) gene in upland cotton and its functional expression in yeast andArabidopsisthalianaplants [J].Plant Physiology and Biochemistry,2009,47(6)：462-471.

[2] O’keefe S F,Wiley V A,Knauft D A.Comparison of oxidative stability of high-and normal-oleic peanut oils[J].Journal of the American Oil Chemists’ Society,1993,70(5)：489-492.

[3] Liu W,Li W,He QL,et al.Characterization of 19 genes encoding membrane-bound fatty acid desaturases and their expression profiles inGossypiumraimondiiunder low temperature [J].Plos One,2015,10(4):e0123281

[4] Beló A,Zheng P,Luck S,et al.Whole genome scan detects an allelic variant of fad2 associated with increased oleic acid levels in maize [J].Molecular Genetics and Genomics,2008,279(1):1-10.

[5] Lee,Lee Y,Kim EH,et al.Functional identification of oleate 12-desaturase and ω-3 fatty acid desaturase genes fromPerillafrutescensvar.frutescens[J].Plant Cell Reports,2016,35(12):2523-2537.

[6] Sun R,Gao L,Yu X,et al.Identification of a Δ12 fatty acid desaturase from oil palm (ElaeisguineensisJacq.) involved in the biosynthesis of linoleic acid by heterologous expression inSaccharomycescerevisiae[J].Gene,2016,591(1):21-26.

[7] Wang Y,Zhang X,Zhao Y,et al.Insights into the novel members of the FAD2 gene family involved in high-oleate fluxes in peanut [J].Genome,2015,58(8):375-383.

[8] Li L,Wang X,Gai J,et al.Isolation and characterization of a seed-specific isoform of microsomal omega-6 fatty acid desaturase gene (FAD2-1B) from soybean [J].DNA Sequence,2008,19(1):28-36.

[9] Pham AT,Shannon JG,Bilyeu KD.Combinations of mutant FAD2 and FAD3 genes to produce high oleic acid and low linolenic acid soybean oil [J].Theoretical and applied genetics,2012,125(3):503-515.

[10] Buhr T,Sato S,Ebrahim F,et al.Ribozyme termination of RNA transcripts down-regulate seed fatty acid genes in transgenic soybean [J].Plant Journal,2002,30(2):155-163.

[11] Menard GN,Moreno JM,Bryant FM,et al.Genome Wide Analysis of Fatty Acid Desaturation and Its Response to Temperature [J].Plant Physiology,2017,173(3):1594-1605.

[12] Chi X,Zhang X,Guan X,et al.Fatty acid biosynthesis in eukaryotic photosynthetic microalgae：identification of a microsomal delta 12 desaturase in Chlamydomonas reinhardtii[J].Journal of Microbiology.2008,46(2):189-201.

[13] Lu Y,Chi X,Yang Q,et al.Molecular cloning and stress-dependent expression of a gene encoding Delta(12)-fatty acid desaturase in the Antarctic microalga Chlorella vulgaris NJ-7[J].Extremophiles，2009,13(6):875-884.

[14] Liang MH,Qv XY,Jin HH,et al.Characterization and expression of AMP-forming Acetyl-CoA Synthetase fromDunaliellatertiolectaand its response to nitrogen starvation stress[J].Scientific reports,2016,30(6):23445.

[15] 孙协军,刘淼,李秀霞,等.盐藻油微波辅助提取工艺优化及脂肪酸组成分析[J].中国粮油学报,2016,31(1):70-75.

[16] McCartney AW,Dyer JM,Kim PK,et al.Membrane-bound fatty acid desaturases are inserted co-translationally into the ER and contain different ER retrieval motifs at their carboxy termini [J].Plant Journal,2004,37(2)：156-173.

[17] Minto RE,Gibbons WJ Jr,Cardon TB,et al.Synthesis and conformational studies of a transmembrane domain from a diverged microsomal Delta(12)-desaturase [J].Analytical biochemistry,2002,308(1):134-140.