PEG胁迫下偏关苜蓿ProDH基因表达与活性分析

贾蓉，庞妙甜，原慧，熊乙，董宽虎，朱慧森

(山西农业大学 动物科技学院，山西 太谷 030801)

植物受到干旱、高盐、低温、重金属胁迫时，会直接或间接的发生水分胁迫，为了缓解逆境对植物细胞造成的伤害，植物体内会积累大量的脯氨酸、可溶性糖和甜菜碱等一系列渗透调节物质[1]。脯氨酸(Proline)作为在生物体内广泛存在的一种渗透调节物质，有助于保持细胞或组织的持水能力，有效缓解水分胁迫对植物细胞造成的损伤[2]，起到稳定蛋白质分子和核酸的作用[3]。在胁迫缓解之后，脯氨酸降解产生的能量可以快速补充植物对碳、氮和能量的需求[4]。植株体内脯氨酸的合成途径有两种，即谷氨酸途径和鸟氨酸途径[5]。脯氨酸的降解代谢途径在脯氨酸运转蛋白(ProT)的协助下将脯氨酸从细胞质运输到线粒体开始，随后被脯氨酸脱氢酶(proline dehydrogenase，ProDH)和P5C脱氢酶催化形成谷氨酸[6],ProDH是此过程的关键限速酶。

目前在很多植物中已经克隆出了ProDH基因[7～12]，研究最深入的是模式植物拟南芥，已发现2种脯氨酸脱氢酶基因，分别是ProDH1和ProDH2，且2个基因是共表达的，只是在基因表达上表现出不同的趋势[9]。同样烟草也有2个ProDH基因，却没有发现共表达现象[11]。ProDH基因在不同物种上有不同的表达模式[13]。目前为止，关于苜蓿中ProDH基因的报道较少，有待进一步研究。

偏关苜蓿(MedicagoSativacv. Pianguan)1993年由山西省农科院畜牧研究所和偏关县畜牧局整理申报登记，此品种是黄土高原地区近几年发现的优良地方苜蓿品种，具有产量高、抗旱、耐寒、营养价值高等优点[14]，近年来，对苜蓿抗旱性的研究已经成为了牧草学研究方向的热点，并逐渐从形态学发展到生理生化及分子生物学等更微观的领域[15]。研究偏关苜蓿在PEG胁迫条件下ProDH活性及基因的表达模式，对于揭示其在干旱条件下脯氨酸的积累机制，培育地方抗旱新种质资源提供科学参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

参照Djilianov[16]等的研究，使用含20% PEG的Hoagland 营养液胁迫生长四周的偏关苜蓿幼苗，分别胁迫处理0 h、24 h、48 h、72 h后，使用无菌水反复冲洗，置于灭菌的滤纸上将水分吸干，采集植物的叶片[7]分装至1.5 mL离心管中，液氮中快速冷冻，-80 ℃保存，用于后期检测。

1.2 试验试剂

PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、DNA marker、SYBR© Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)均购自宝生物工程(大连)有限公司，琼脂糖购自Invitrogen，氯仿、异丙醇、乙醇等试剂均为国产分析纯。

1.3 试验方法

1.3.1 脯氨酸含量测定

参照赵福庚等[17](2002)的方法测定偏关苜蓿在PEG胁迫不同时间点的脯氨酸含量。

1.3.2 脯氨酸脱氢酶活性测定

参照赵福庚等[17](2002)的方法测定偏关苜蓿PEG胁迫不同时间点的ProDH活性。

1.3.3 偏关苜蓿ProDH基因表达量测定

采用传统Trizol方法提取偏关苜蓿Total RNA[18]。使用Quawell Q500核酸蛋白检测仪测定RNA浓度及OD260/280值，通过琼脂糖凝胶电泳检测提取得到的Total RNA的质量，参照 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser说明书去除基因组DNA反转录成cDNA。

根据已报道豆科牧草蒺藜苜蓿CDS区序列[19]，采用Primer5.0软件设计引物(表1)。

表1 引物序列Table 1 Sequence of primers

(1)qRT-PCR反应体系：

cDNA2μLPCRForwardPrimer0.8μLPCRReversePrimer 0.8μLROXReferenceDye0.4μLSYBRPremixEixTaqTMII10μLdH2O6μLTotal20μL

以10倍稀释的cDNA为模版，根据SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)说明书，使用ABI PRISM 7500 Real-time PCR System(ABI，USA)，按照下列体系和反应条件采用qRT-PCR分析方法测定ProDH基因的相对表达量。

(2)反应条件：

采用95 ℃预变性30 s，95 ℃变性5 s，60 ℃退火延伸34 s，40个循环，再经过95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s进行熔解曲线分析。

1.3.4 数据处理

本次试验采用ΔΔCt法进行qRT-PCR数据的处理，即在内参基因和目的基因扩增效率相同的情况下，目的基因的含量=2-ΔΔCt，其中，ΔΔCt=(CtTarget-CtActin)处理组-(CtTarget-CtActin)对照组，2-ΔΔCt表示试验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数。本试验数据采用Excel 2003和SAS9.3统计分析软件进行方差分析，所有数据均采用Mean±SE的形式，P<0.05表示数据差异性显著。所有试验均经过至少3次独立试验。

2 结果与分析

2.1 PEG胁迫对偏关苜蓿脯氨酸含量的影响

如图1所示，随着胁迫时间的延长脯氨酸含量逐渐增加，各处理组间差异均显著(P<0.05)，并在胁迫72 h时含量达到最高，为392.2 μg·g-1。

图1 PEG胁迫对脯氨酸含量的影响Fig.1 Proline content under PEG stress 注: 数据采用Mean±SE的形式，肩标不同小写字母(a、b、c、d)表示各组之间差异显著(P﹤0.05)，下同。Note: Data were expressed as Mean±SEM. Data with different letters (a, b, c, d) indicated that the group was significant different from other groups (P<0.05), the same as follow.

2.2 PEG胁迫对偏关苜蓿ProDH活性的影响

图2显示了偏关苜蓿在PEG不同时间胁迫处理下植株中ProDH活性的变化。如图所示，植株在干旱胁迫0 h、24 h、48 h和72 h下ProDH的活性发生明显变化，随着胁迫时间的延长ProDH的活性逐渐降低，各处理组间差异均显著(P<0.05)，在胁迫72 h后活性达到最低,降到21.35 U·mg-1FW。

图2 PEG胁迫对ProDH活性的影响Fig.2 ProDH activity under PEG stress

2.3 偏关苜蓿Total RNA纯度检测

提取偏关苜蓿植株总RNA，经1%凝胶电泳检测结果显示清晰的28sRNA、18sRNA 和5sRNA条带(图3)，且28sRNA、18sRNA亮度比为2∶1，说明RNA完整；经Quawell Q5000 核酸蛋白检测仪检测OD260/280 值均在1.8～2.0之间，表明RNA 无降解、无明显的酚类或者蛋白质的污染，可用于后续试验。

图3 偏关苜蓿总RNA凝胶电泳Fig.3 Agarose gel electrophoresis validation of RNA from Medicago sativa cv.Pianguan

2.4 荧光定量PCR反应条件的确定

样品进行实时定量扩增后，得到一条反应核酸扩增过程的S形荧光定量动力学曲线，循环阈值位于PCR产物消除荧光背景后进入指数增长期的始点。图4和5显示，溶解曲线为单峰，且扩增曲线的基线平整，拐点清楚即指数区较明显，扩增曲线整体平行性好。

图4 内参实时扩增曲线图及产物Fig.4 Amplification and dissociation plots of reference gene

图5 目的基因实时扩增曲线图及产物溶解曲线图Fig.5 Amplification and dissociation plots of target gene

2.5 ProDH基因在PEG干旱胁迫下的表达

用20% PEG对偏关苜蓿进行不同时间的胁迫处理，通过qRT-PCR分析在不同时间的ProDH基因的相对表达量。如图6所示，随着胁迫时间的延长偏关苜蓿ProDH基因的相对表达量逐渐增加，与处理0 h相比，处理24 h、48 h和72 h下ProDH基因的相对表达量显著增加(P<0.05)，且与时间呈正相关。各处理组间，ProDH基因的相对表达量均有显著性差异(P<0.05)。

3 讨论与结论

植物在干旱等非生物胁迫下，脯氨酸的积累是对逆境胁迫下的一种适应性应答，积累过程是合成与降解两个过程共同作用的结果，脯氨酸的合成主要有谷氨酸和鸟氨酸两种途径。王丽媛[20]的研究认为在植物受到逆境胁迫时，脯氨酸的主要合成途径是谷氨酸合成途径，而脯氨酸的降解主要受到ProDH调控，ProDH造成脯氨酸含量下降，加剧植物细胞干旱胁迫伤害。本研究对偏关苜蓿受到干旱胁迫时脯氨酸含量、ProDH的酶活力及其基因表达量进行了分析，发现随着胁迫时间的延长脯氨酸的含量逐渐升高，ProDH活力逐渐降低，这一趋势与理论结果相同。但是对ProDH基因表达量测定发现随着胁迫时间的延长，基因表达量上升，且明显高于对照组，这与ProDH的活性趋势并不一致。

Ribarits等[11]和Funck等[12]在拟南芥和烟草中均克隆到了2个有功能的ProDH基因，通过对拟南芥、烟草等植物进行胁迫处理发现ProDH基因的表达模式和调控模式不相同，表明了不同物种间脯氨酸的合成和降解代谢途径不尽相同，具有明显的种间特异性和组织特异性。同样，魏丽娟等[21]的研究结果也显示ProDH基因表达模式与植株ProDH活性结果不一致，得出该基因的酶活性受到转录和翻译水平的双重调控的结论。因此推测偏关苜蓿中极有可能存在多个ProDH基因，并且受到了转录和翻译双重调控，对这一现象仍需通过进一步试验进行验证。在不同的植物物种中，ProDH的调控方式存在着很大差异, 因此研究不同物种ProDH的特性，才能揭示该酶在本物种抗逆和生长发育中发挥的作用。

qRT-PCR通过检测PCR产物中荧光信号强度来定量PCR的产物，具有精确度高、操作简单、效率高等优点[22]。本试验以偏关苜蓿叶片总RNA反转录得到的cDNA为模版，以β-actin为内参，鉴定了ProDH在PEG干旱胁迫处理下的表达情况，为ProDH基因在苜蓿中的表达调控研究积累了资料。

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